大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆與表達研究.pdf

1、本論文克隆了大菱鲆mIgD基因cDNA全序列，序列特性分析顯示其含有免疫球蛋白家族所有的經典結構域。RT-PCR分析該基因在不同組織內的差異表達情況，實時熒光定量PCR檢測鰻弧菌刺激后前腎中該基因的時空差異表達情況，推測魚類mIgD在免疫信號傳導及體液免疫防御中均可能起著重要作用。在序列分析的基礎上對其進行分段表達，構建mIgD的δ區(qū)重組表達載體，并制備了其多克隆抗體。利用其與大菱鲆外周血白細胞間接免疫熒光實驗，結果顯示兩者發(fā)生了特異性

2、結合，說明了外周血白細胞的細胞膜上存在膜結合型mIgD。
　　本論文主要包括以下三部分：
　　1、大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆
　　設計簡并引物擴增大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的中間保守序列，通過RACE技術獲得mIgD cDNA序列，序列全長3357bp，含一個2997bp的開放閱讀框，編碼999個氨基酸，基因結構為VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重鏈恒定區(qū)δ1~δ7氨基酸序列同源比對

3、結果顯示其與庸鰈（78％）、鱖魚（71%）、牙鲆（68%）具有較高的同源性，多序列比對結果顯示大菱鲆mIgD的每個δ恒定區(qū)內均存在色氨酸與半胱氨酸保守位點。利用鄰位相連法構建硬骨魚類免疫球蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示不同魚類IgD聚為一大支，大菱鲆mIgD與庸鰈及牙鲆聚為一支。
　　2、大菱鲆mIgD重鏈基因的表達分析
　　利用RT-PCR分析了大菱鲆mIgD重鏈基因的組織差異表達，結果顯示其在外周血白細胞、脾臟、前腎及中腎組織

4、中具有較高的表達。將大菱鲆腹腔注射福爾馬林滅活鰻弧菌后，實時熒光定量PCR檢測了其前腎組織中mIgD重鏈基因應答表達量，結果顯示mIgD重鏈基因在注射鰻弧菌后呈現顯著下調趨勢，在注射后8h時降至最低值，其相對表達量約為對照組的1/28左右，然后呈逐漸回復上調趨勢，在免疫后48h時免疫組mIgD相對表達量與對照組無顯著差異水平。
　　3、大菱鲆mIgDδ恒定區(qū)基因的重組表達及其多抗的制備
　　構建了mIgDδ恒定區(qū)融合表達載體