樂(lè)果對(duì)興奮性氨基酸遞質(zhì)系統(tǒng)以及腦特異性蛋白的影響.pdf

1、眾多研究表明中樞興奮性氨基酸遞質(zhì)系統(tǒng)(excitatory amino acid systemI,EAAs)在急慢性有機(jī)磷中毒、以及急性腦缺血、腦損傷和中毒性腦病以及慢性神經(jīng)退行性變性疾病如帕金森病、亨廷頓舞蹈病等的病因形成中發(fā)揮著重要作用[1,2]。本實(shí)驗(yàn)室已有研究也證明了EAAs在樂(lè)果中毒后的神經(jīng)毒性中的作用不可忽視,NMDA受體通路的拮抗劑MKS01能夠部分改善樂(lè)果引起的SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降[3]。腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)的合成

2、釋放以及消除是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)及NMDA受體通路都是腦內(nèi)EAAs保持平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此在整體動(dòng)物以及細(xì)胞水平繼續(xù)深入探討樂(lè)果染毒后大腦皮層EAAs的變化對(duì)闡明有機(jī)磷中毒的非膽堿能機(jī)制意義重大。
　　此外,雖然眾多研究都在探討有機(jī)磷農(nóng)藥暴露與某些神經(jīng)行為疾病之間的聯(lián)系,但迄今為止,仍缺乏敏感特異的神經(jīng)生化指標(biāo)。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE),膠質(zhì)酸性纖維蛋白(Gli

3、al Fibrillary Acidic Protein,GFAP)與酸性鈣結(jié)合蛋白S100β,是腦特異性蛋白,特異的表達(dá)于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中,近年來(lái)常被用作臨床急性腦損傷的診斷中,因此也被稱為腦損傷相關(guān)蛋白。據(jù)報(bào)道,血清或腦脊液中NSE以及S100β的升高常與疾病的嚴(yán)重程度以及預(yù)后高度相關(guān)[4,5]。在本研究中,將從整體動(dòng)物以及離體細(xì)胞模型兩個(gè)方面來(lái)探討樂(lè)果染毒后NSE、GFAP以及S100β作為神經(jīng)毒性生物標(biāo)志的可能性,期望為有

4、機(jī)磷暴露后可能誘導(dǎo)的神經(jīng)疾病提供診斷及預(yù)后的依據(jù)。
　　在大鼠急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒模型中,單次灌胃38.9mg/kg·bw,83.7mg/kg·bw和180.0mg/kg·bw的樂(lè)果染毒后,與對(duì)照組相比,高劑量樂(lè)果染毒組中,大腦皮層M1受體亞型mRNA表達(dá)的下降以及NMDA受體NR1亞基mRNA表達(dá)上升(P＜0.01);皮層NSE、MAP-2(Microtubule-associated protein-2)、GFAP以及S100β

5、mRNA表達(dá)的變化與對(duì)照組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　在大鼠90天樂(lè)果中毒模型中,大鼠重復(fù)灌胃5mg/kg·bw,10mg/kg·bw或20mg/kg·bw樂(lè)果,每周5天,共13周。與對(duì)照組相比,大腦皮層低劑量樂(lè)果染毒劑量組M1受體mRNA表達(dá)下降為對(duì)照組的61.2％(P＜0.05);中、高劑量組谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)活性下降(P＜0.01),NR1、NR2B受體mRNA表達(dá)上升(P＜0.0

6、1),NSE mRNA表達(dá)上升(P＜0.01);三個(gè)劑量組中MAP-2的mRNA表達(dá)均上升(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01);高劑量組GFAP、S100βmRNA表達(dá)水平都有顯著上升。0.05mg/kg·bw和0.1mg/kg·bw MK801干預(yù)后,高劑量干預(yù)組NMDA mRNA表達(dá)和GS活性較干預(yù)前上升(P＜0.01),也高于對(duì)照組水平(P＜0.01);四個(gè)腦特異性蛋白的mRNA表達(dá)均下降(P＜0.01),且呈劑量依賴趨勢(shì)

7、。
　　在純化培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中,與對(duì)照組相比,10-4M樂(lè)果染毒48h后EAA(excitatory amino acid)的含量均上升(P＜0.01);10-6M、10-5M及10-4M劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS(reactive oxygen species)水平逐漸增高,分別為對(duì)照組的2.1,2.28和2.47倍(P＜0.01);凋亡隨樂(lè)果染毒劑量的增加而增加,Tunel(terminaldeoxynucleotidyl tral

8、lsferase mediated dUTP nick end labelling)染色強(qiáng)度分別為對(duì)照組的1.18,1.36和1.40倍(P＜0.01):NSE mRNA表達(dá)升高,高劑量組為對(duì)照組的1.35倍(P＜0.01),10-5M及以10-4M組NSE蛋白表達(dá)分別為對(duì)照組的1.053和1.048倍(P＜0.01)。對(duì)樂(lè)果高劑量組給予500μM和100μM MK801干預(yù)后,EAA含量下降(P＜0.01);細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降為高劑

9、量樂(lè)果染毒組的88.9％和74.8％(P＜0.01),但仍遠(yuǎn)高于對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(P＜0.01);NR2B mRNA表達(dá)上升為干預(yù)前的1.59和2.22倍(P＜0.01),顯著高于對(duì)照組水平(P＜0.01);NSEmRNA表達(dá)下降為干預(yù)前的75.7％和73.2％,有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01),與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,NSE蛋白表達(dá)下降為對(duì)照組的73.4％和72.8％(P＜0.01),均己降至對(duì)照組以下(P＜0.01

10、),提示出現(xiàn)神經(jīng)元的崩解壞死。在純化培養(yǎng)的皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中,給予10-6M,10-5M,10-4M樂(lè)果染毒48h,GS活性、NR2B、GLT-1mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異;GLASTmRNA表達(dá)下降為對(duì)照組的67.8％、68.6％和76.2％(P＜0.05);高劑量組EAA含量下降(P＜0.01):GFAP、S100BmRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均明顯上升(P＜0.01),有劑量依賴趨勢(shì)。對(duì)樂(lè)果高劑量組給予50μM和100μM M

11、K801干預(yù)后,GLT-1、GLASTmRNA表達(dá)水平上升(P＜0.01),但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;NR2BmRNA表達(dá)進(jìn)一步升高,與未干預(yù)前相比沒(méi)有顯著性差異,但均顯著高于對(duì)照組水平(P＜0.05,P＜0.01);Glu的含量升高為干預(yù)前的1.81倍,有顯著性差異(P＜0.01);GFAP轉(zhuǎn)錄及蛋白水平下降,但仍然高于對(duì)照組表達(dá)水平;低劑量干預(yù)組S100β蛋白表達(dá)與上升,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　采用體

12、外皮層神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少量其他膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)模型,給予10-6M,10-5M,10-4M樂(lè)果染毒,AChE活性、ChAT活性以及GS活性均下降;EAA的含量均下降(P＜0.01);高劑量組NR2BmRNA表達(dá)上升為對(duì)照組的1.82倍(P＜0.05);三個(gè)劑量組中NSE蛋白表達(dá)升高為對(duì)照組的1.46,1.60和1.98倍(P＜0.01):高劑量組GFAP、S100B的mRNA表達(dá)上升,為對(duì)照組的1.97和2.15倍(P＜0.0

13、5),中高劑量組GFAP及S100B的蛋白表達(dá)明顯上升(P＜0.01)。對(duì)樂(lè)果高劑量組給予50μM和100μM MK801干預(yù)后,高劑量干預(yù)組NR2BmRNA表達(dá)為干預(yù)前的65.5％(P＜0.05),Asp和Glu含量上升為干預(yù)前的2.35和1.78倍(P＜0.01),與對(duì)照組相比也有顯著性差異(P＜0.01);NSE的蛋白水平下降為干預(yù)前的96.2％(P＜0.01),遠(yuǎn)高于對(duì)照組水平(P＜0.01);GFAPmRNA表達(dá)下降為干預(yù)前的

14、48.7％(P＜0.05),兩個(gè)干預(yù)組中的GFAP蛋白表達(dá)均下降為干預(yù)前的88.8％和83.4％(P＜0.01,P＜0.01),且與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異;S100BmRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)在兩個(gè)MK801干預(yù)組中均較干預(yù)前下降(P＜0.01)。
　　以上整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及離體細(xì)胞模型研究結(jié)果提示,樂(lè)果作用于EAAs代謝與消除過(guò)程有關(guān)的酶及NMDA受體來(lái)影響中樞EAAs,并造成NSE、GFAP、S100BmRNA和蛋白表達(dá)的紊亂,同

15、時(shí)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力降低。NMDA受體拮抗劑MK801干預(yù)后,EAAs的變化大致趨于對(duì)照組水平,NSE、GFAP以及S100B的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)也大致趨于對(duì)照組水平,同時(shí)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明MK801能夠改善SD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。提示中樞EAAs的紊亂是樂(lè)果中毒后神經(jīng)毒性的部分原因;這三個(gè)腦特異性蛋白的mRNA表達(dá)與SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化表現(xiàn)一致,能夠作為樂(lè)果染毒后神經(jīng)毒性的生物標(biāo)志;MK801的干預(yù)對(duì)樂(lè)果誘導(dǎo)的神