四肢周圍神經(jīng)功能束三維可視化的關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、研究背景： 周圍神經(jīng)損傷修復(fù)術(shù)中，最理想的是能做到相同性質(zhì)的神經(jīng)束能進(jìn)行對接，但無論是顯微解剖的圖譜還是組織化學(xué)染色的切片，都是孤立的二維斷面，缺乏連續(xù)性和在復(fù)雜臨床環(huán)境下的定位指導(dǎo)性，其主要原因是不能形象地反映神經(jīng)在其全長的內(nèi)部結(jié)構(gòu)中神經(jīng)束的連續(xù)性及其變化規(guī)律，難以滿足手術(shù)中結(jié)合部位隨機(jī)對照調(diào)整以進(jìn)行精確的神經(jīng)功束組吻合修復(fù)的要求。近年來計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展提供了平面圖像三維構(gòu)建的可能。此前，國內(nèi)外目前有關(guān)神經(jīng)內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)的三

2、維重建尚處起步階段。 本研究著眼于此，擬對周圍神經(jīng)三維重建過程中實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵技術(shù)、全景標(biāo)準(zhǔn)化圖像獲取及連續(xù)組織切片的計(jì)算機(jī)自動圖像配準(zhǔn)和輪廓提取、分割等關(guān)鍵技術(shù)路線進(jìn)行研究；并驗(yàn)證Amira等第三方三維重建軟件重建的可適性，進(jìn)一步整合二維及三維軟體平臺，為實(shí)現(xiàn)周圍神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)三維重建的計(jì)算機(jī)自動化提供醫(yī)學(xué)背景和技術(shù)參考，進(jìn)而確立一整套成熟標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)路線，為海量切片構(gòu)建周圍神經(jīng)可視化數(shù)字模擬系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫提供現(xiàn)實(shí)可行的方法。 目

3、的： 1.基于周圍神經(jīng)組織包埋劑包埋超薄冰凍切片技術(shù)，以4根成年女性頭發(fā)作為標(biāo)志線，固定于神經(jīng)四周，分別以普通玻片及防脫多聚賴氨酸涂層硅化玻片為載體貼片及AChE及HE染色，觀察不同貼片載體及不同染色方法下頭發(fā)標(biāo)志線的貼片情況，比較分析各組間頭發(fā)標(biāo)志線染色前、后的貼片率，以評估一次性獲取染色后帶完整標(biāo)志定位點(diǎn)的神經(jīng)二維圖像的可行性。 2.基于周圍神經(jīng)切片的Kamovsky—Roots鐵氰化銅法乙酰膽堿酯酶染色方法，通過對

4、比神經(jīng)斷面染色切片光學(xué)掃描儀掃描、顯微鏡下分區(qū)攝像拼接和高像素全景數(shù)碼成像裝置一次性全景成像獲得的數(shù)字化神經(jīng)斷面全景二維圖像的特點(diǎn)，以評估全景數(shù)碼成像用于神經(jīng)功能束三維重建的可行性，以簡化拼接等中間程序，減少系統(tǒng)誤差，從而解決重建中神經(jīng)斷面全景二維圖像獲取的關(guān)鍵技術(shù)問題。 3.基于周圍神經(jīng)斷面全景數(shù)碼成像技術(shù)并結(jié)合Photoshop二維圖像處理軟件，嘗試開發(fā)神經(jīng)斷面二次成像及合成處理技術(shù)，以獲取含有4個(gè)配準(zhǔn)標(biāo)志點(diǎn)的完整信息的神經(jīng)

5、二維斷面全景圖像，以解決切片染色過程中配準(zhǔn)標(biāo)志點(diǎn)的丟失這一二維圖像制備中的關(guān)鍵難題。 4.聯(lián)合廣東工業(yè)大學(xué)自動化學(xué)院，基于含完整標(biāo)志點(diǎn)的周圍神經(jīng)切片功能束Karnovsky—Roots鐵氰化銅法乙酰膽堿酯酶染色二維圖像特點(diǎn)，嘗試開發(fā)醫(yī)學(xué)二維圖像配準(zhǔn)及輪廓獲取、圖像分割等軟件，以期實(shí)現(xiàn)二維圖像的自動配準(zhǔn)及不同信息的分割獲取，減少手工操作，提高重建精度及效率，以解決三維重建前二維圖像前期處理中的關(guān)鍵性技術(shù)問題。 5.在以上關(guān)

6、鍵技術(shù)流程的基礎(chǔ)上，利用市售第三方醫(yī)學(xué)三維重建軟件(Amira軟件)進(jìn)行上臂20cm長尺神經(jīng)功能束三維重建，觀察重建效果，評估軟件重建可適性，并開發(fā)任意角度虛擬切割算法，以驗(yàn)證三維重建的逆向還原真實(shí)度；同時(shí)通過對上臂長段尺神經(jīng)功能束三維重建，觀察其功能束的變化規(guī)律，為臨床臂叢神經(jīng)損傷相關(guān)術(shù)式(Oberlin術(shù)式等)提供可視化直觀的解剖學(xué)依據(jù)。 材料和方法： 1.新鮮成人截肢坐骨神經(jīng)標(biāo)本，以4根成年女性頭發(fā)作為標(biāo)志線，固定

7、于神經(jīng)四周，橫斷面連續(xù)冰凍切片100張，片厚10μm，隨機(jī)分為4組，每組25張切片，分別以不同玻片載體(多聚賴氨酸涂層防脫硅化玻片貼片和普通玻片)貼片及不同染色方法(HE染色及Karnovsky—Roots法AChE組織化學(xué)染色)每組染色前、后均以Z61型體視顯微鏡+MSHOT MD90顯微數(shù)碼成像裝置一次性全景數(shù)碼成像，明美圖像采集軟件進(jìn)行圖像采集，ACDSEE Pro2視圖軟件進(jìn)行圖形分析及標(biāo)志點(diǎn)計(jì)數(shù)，比較各組間及染色前后人發(fā)標(biāo)志線

8、粘附情況。 2.新鮮成人截肢腓總神經(jīng)標(biāo)本冰凍切片，Karnovsky—Roots鐵氰化銅法AChE組織化學(xué)孵育24小時(shí)，分別以100×光學(xué)顯微鏡下分區(qū)數(shù)碼拍照后Autositch拼接軟件拼接獲取神經(jīng)斷面全景圖像和高分辨率光學(xué)掃描儀掃描及OLYMPUS數(shù)碼全景成像儀一次性獲取神經(jīng)斷面全景圖像，對比3組圖像的神經(jīng)功能束生理信息完整性、神經(jīng)束輪廓清晰度等指標(biāo)。 3.新鮮成人截肢坐骨神經(jīng)標(biāo)本，四條女性頭發(fā)絲標(biāo)志線OCT二次包埋，

9、橫斷面連續(xù)冰凍切片，片厚15μm，普通玻片貼片，采用二次成像技術(shù)，即用900萬像素OLYMPUS數(shù)碼全景成像儀于AChE染色前和組織化學(xué)孵育24小時(shí)后分別獲取同一切片的兩張全景圖像，比較兩張圖像神經(jīng)輪廓吻合度，通過PhotoshopCS2圖層疊加和合并功能進(jìn)行圖像處理，以獲取含完整4個(gè)定位標(biāo)志點(diǎn)的神經(jīng)斷面二維全景圖像。 4.基于含4個(gè)標(biāo)志點(diǎn)的坐骨神經(jīng)切片功能束AChE染色二維圖像特點(diǎn)，開發(fā)模式識別中先進(jìn)的優(yōu)化最小二乘支持向量機(jī)方

10、法(optimized least square support vector machine，Optimized LS—SVM)作為分類器結(jié)合計(jì)算機(jī)圖形學(xué)中的拉伸與平移，對圖像進(jìn)行處理，利用外控制點(diǎn)配準(zhǔn)神經(jīng)切片圖像。對于二維圖像的功能束邊緣獲取，嘗試采用改進(jìn)k—均值聚類方法及像素點(diǎn)“蠶食”的方法獲取神經(jīng)束邊界，完成二維圖像的配準(zhǔn)及分割計(jì)算機(jī)算法設(shè)計(jì)。 5.基于上述神經(jīng)連續(xù)切片AChE組織化學(xué)染色二維全景圖像獲取、計(jì)算機(jī)自動配準(zhǔn)

11、和分割的技術(shù)操作流程，以上臂腋窩至肱骨髁間連線平面25cm尺神經(jīng)為研究對象，通過Amira醫(yī)學(xué)三維重建軟件進(jìn)行長段尺神經(jīng)功能束三維重建，評估重建逆向還原效果及重建軟件可適性，分析上臂尺神經(jīng)功能束走行及變化規(guī)律。 結(jié)果： 1.不同玻片載體及不同染色方法染色后100張切片人發(fā)標(biāo)志點(diǎn)脫失均較嚴(yán)重，僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)標(biāo)志點(diǎn)完整的圖像1例，多數(shù)完全丟失或僅殘留1個(gè)標(biāo)志點(diǎn)，另有部分介于2～3個(gè)點(diǎn)之間，部分標(biāo)志點(diǎn)移位明顯。各組間人發(fā)在玻片上存

12、留的數(shù)量級別無明顯差異(P>0.05)；染色前100張圖像具完整的4個(gè)人發(fā)標(biāo)志點(diǎn)的有98張，完整粘附率達(dá)98.00％，總體粘附率為99.50％，而染色后100張圖像的人發(fā)完整粘附率為1％，總體粘附率為22.50％，染色前后人發(fā)標(biāo)志點(diǎn)數(shù)量有顯著性差異(P<0.01) 2.AChE染色切片掃描圖像屬一次性全景成像，成像快捷方便，但輪廓欠清晰，且無法根據(jù)圖像本身進(jìn)行神經(jīng)束性質(zhì)鑒別，實(shí)際應(yīng)用中需要對照鏡下圖像對每張圖像進(jìn)行逐張、逐個(gè)神經(jīng)

13、束的功能性質(zhì)鑒別；100倍光學(xué)顯微鏡下定焦分次攝影拼接而成的二維全景圖像屬分次全景成像，神經(jīng)束輪廓清晰，圖像包含了可染色的神經(jīng)纖維功能性質(zhì)的全部生理信息，可直接在圖像上進(jìn)行明確的神經(jīng)束功能性質(zhì)鑒別；高像素全景數(shù)碼成像裝置可一次全景成像，變形細(xì)微，神經(jīng)束輪廓清晰，功能束區(qū)分明顯易于鑒別，基本具備高倍光學(xué)顯微鏡下拼接圖像的特點(diǎn)。 3.神經(jīng)斷面切片染色前照片人發(fā)標(biāo)志點(diǎn)完整貼片率很高，位置準(zhǔn)確，能滿足配準(zhǔn)的要求，利用PHOTOSHOP圖

14、層合并功能處理同一張切片染色前后的圖像，圖像輪廓吻合度良好，合成圖像獲得的標(biāo)志點(diǎn)定位精確，而且整個(gè)操作過程簡單快捷。 4.采用模式識別中先進(jìn)的優(yōu)化最小二乘支持向量機(jī)方法(optimized least square support vector machine，Optimized LS—SVM)作為分類器結(jié)合計(jì)算機(jī)圖形學(xué)中的拉伸與平移，利用外控制點(diǎn)配準(zhǔn)神經(jīng)切片圖像，配準(zhǔn)精確度高，誤差率只有8.25％；采用粗糙k—均值聚類法和像素

15、點(diǎn)“蠶食”的方法獲取的神經(jīng)邊緣完整，信息丟失少，邊緣圓潤，但需調(diào)高圖像灰度才能獲得較好的提取效果，增加了功能束性質(zhì)的鑒別困難。 5.應(yīng)用Amira3.1基于神經(jīng)連續(xù)組織切片自動配準(zhǔn)+人工輔助輪廓獲取可實(shí)現(xiàn)上臂長段尺神經(jīng)內(nèi)部功能束的三維重建。重建的20.0cm長的尺神經(jīng)內(nèi)部功能束的三維結(jié)構(gòu)，可直觀的觀察到神經(jīng)內(nèi)部不同性質(zhì)功能束交叉融合的變化，并可以單獨(dú)提取、合并或任意組合顯示，還可在矢狀軸、冠狀軸、水平軸進(jìn)行剖切和任意角度旋轉(zhuǎn)觀察

16、，其中同一通道的輪廓和走行漸變功能可輔助糾正神經(jīng)切片的變形，升級的版本還具有標(biāo)尺參數(shù)后的數(shù)據(jù)測量功能及任意角度斜切的功能。結(jié)合400張尺神經(jīng)斷面切片和重建三維模型的觀察，發(fā)現(xiàn)人體上臂尺神經(jīng)內(nèi)部功能束有如下特點(diǎn)：①功能束以運(yùn)動和感覺的混合束為主，②功能束間交叉融合非常頻繁，至中上1/3段分束最多；③神經(jīng)束自腋窩段至上臂中段開始逐漸集中，在上臂中段3cm范圍內(nèi)完成2次完全融合。 結(jié)論： 1.人發(fā)作為周圍神經(jīng)超薄冰凍組織切片標(biāo)

17、志點(diǎn)染色后貼片率較低，不能滿足目前配準(zhǔn)軟件的算法要求。 2.染色前結(jié)晶狀態(tài)下的周圍神經(jīng)切片標(biāo)本人發(fā)標(biāo)志點(diǎn)完整貼片率很高，基于同一張切片AChE染色前后二次成像技術(shù)和Photoshop圖層處理技術(shù)，可獲取具備完整定位標(biāo)志點(diǎn)周圍神經(jīng)二維全景圖像，可解決三維重建前配準(zhǔn)標(biāo)志點(diǎn)的獲取的關(guān)鍵技術(shù)問題。 3.體視全景數(shù)碼成像儀高像素一次性全景數(shù)碼成像為神經(jīng)功能束三維重建獲取全景二維圖像較好的方法。 4.基于含4個(gè)標(biāo)志點(diǎn)優(yōu)化最小