核盤菌受真菌病毒抑制的基因的鑒定和分析.pdf

1、核盤菌是油菜上的重要病原真菌，嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，由其引起的菌核病目前仍然沒有理想的防治措施。真菌病毒侵染后，核盤菌EP-1PN菌株的表型發(fā)生了顯著的改變，包括致病力衰退、生長緩慢和菌落形態(tài)異常等。這些表型的變化是核盤菌基因表達(dá)發(fā)生變化的反映，研究這些基因及其表達(dá)，有助于深入理解核盤菌的致病機(jī)理，建立新的防治策略。為了鑒定出這些差異表達(dá)的基因，本研究以感染真菌病毒的弱毒株EP-1PN和它的子囊孢子單孢分離物—強(qiáng)毒株EP-1PNAa

2、為材料進(jìn)行了以下研究： 以EP-1PNAa的mRNA為材料建立了cDNA噬菌體文庫，該文庫的滴度約為109pfu/ml，空斑率為2.4％。 以弱毒株EP-1PN的不同生長時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA作為探針，與構(gòu)建的不同生長時(shí)期的核盤菌強(qiáng)毒力菌株EP-1PNAa(弱毒株EP-1PN的單孢分離物)的cDNA噬菌體文庫進(jìn)行雜交，挑選出差異表達(dá)的克隆1116個(gè)。 將插入片段大于1000bp的克隆(210個(gè))進(jìn)行測列分析

3、，并在NCBI上將這些序列進(jìn)行nr數(shù)據(jù)庫的BLASTX相似性搜索，去除重復(fù)之后，139個(gè)克隆的序列與該數(shù)據(jù)庫的序列具有一定程度的相似性，12個(gè)序列在數(shù)據(jù)庫中沒有相似性序列存在。根據(jù)比較結(jié)果將推定的不同功能的基因按照MIPS基因功能分類方法進(jìn)行了分類。從功能的分類結(jié)果上看，被抑制表達(dá)的克隆所代表的基因功能涉及到代謝、能量、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、蛋白命運(yùn)、物質(zhì)運(yùn)輸、液泡運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架生物合成、細(xì)胞防御、細(xì)胞骨架排列以及未分類蛋白等12類

4、。其中可能與核盤菌和其它病原菌致病過程相關(guān)的克隆主要有三類：細(xì)胞防御、蛋白命運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)，占總克隆的20％。 在此基礎(chǔ)上，對所獲得的210個(gè)克隆進(jìn)行了反向Northern和部分基因的Northern雜交分析。反向Northern結(jié)果顯示挑選的克隆與強(qiáng)毒株mRNA探針雜交時(shí)絕大多數(shù)均有信號(hào)，而與弱毒株mRNA探針雜交時(shí)極少數(shù)才有信號(hào)。表明差異篩選具有較高的可靠性，同時(shí)說明真菌病毒影響寄主基因表達(dá)的廣泛性。選取其中的18個(gè)克隆進(jìn)行了

5、不同時(shí)期RNA表達(dá)水平的Northern雜交檢測，其中12個(gè)(66％)克隆的表達(dá)在強(qiáng)毒、弱毒株之間表現(xiàn)出明顯的信號(hào)差異，即強(qiáng)毒株中有顯著的信號(hào)，而弱毒株中雜交信號(hào)弱或無信號(hào)，表明這些克隆所代表的基因在病毒侵染的核盤菌弱毒株中被抑制表達(dá)。這12個(gè)克隆包括核盤菌重要的致病相關(guān)因子內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶(endopolygalacturonase)，在M.grisea及其它病原真菌和動(dòng)植物中參與毒力形成的親環(huán)素(Cyclophilin)及在Bl

6、umeriagraminis和M.grisea等中參與真菌與寄主互作的aldo-ketoreductasehomologue。其它還包括參與蛋白調(diào)節(jié)作用的鋅指蛋白(zinc-fingerprotein)，能量合成相關(guān)磷酸甘油酸酯激酶(Phosphoglyceratekinase)和磷酸甘油酸脫水酶2-phosphoglyceratedehydratase(Enolase)，蛋白合成前體40Sribosomalprotein，參與離子運(yùn)輸

7、的無機(jī)焦磷酸酶(Ippase)，這些基因可能參與核盤菌的致病過程，但對致病力的貢獻(xiàn)，尚待進(jìn)一步的研究。 本研究對克隆MVSG530進(jìn)行了更深一步的研究，同源性比較發(fā)現(xiàn)該基因是在許多生物體中都十分保守的一類基因家族，這類基因家族對病原菌的生長發(fā)育及致病力的形成普遍都起關(guān)鍵的作用，我們根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)用免疫抑制藥物環(huán)孢菌素CsA對核盤菌生長菌絲進(jìn)行處理，結(jié)果表明核盤菌中存在CsA作用的活性位點(diǎn)，即Cyclophilin基因，實(shí)驗(yàn)初步結(jié)