單一田塊核盤菌多樣性分析及攜帶真菌病毒的菌株遺傳特性研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種世界性分布的重要病原菌,能夠侵染75科450多種植物,常見(jiàn)的重要寄主包括油菜、大豆、向日葵等油料作物和多種蔬菜作物。以油菜為例,由核盤菌引起的菌核病是油菜上的首要病害,一般發(fā)病率為10-30％,嚴(yán)重達(dá)80％以上,嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量以及品質(zhì)。高效、安全的防控措施研究一直是菌核病研究重點(diǎn)。利用致病力衰退相關(guān)病毒控制真菌病害是一種重要的生物防治途徑。包括

2、核盤菌在內(nèi),目前已在很多真菌中發(fā)現(xiàn)有致病力衰退相關(guān)的真菌病毒,但是所發(fā)現(xiàn)的種類極其有限。本論文研究旨在從核盤菌中尋找和鑒定更多的真菌病毒,并研究這些病毒對(duì)寄主的影響。
　　 從湖北省孝感市郊區(qū)同一油菜田(面積約666 m2)的不同發(fā)病植株的莖稈病斑上成功分離獲得了83株核盤菌菌株,通過(guò)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲干重、菌核大小及數(shù)量、菌落形態(tài)、和致病力等生物學(xué)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诰湫螒B(tài)、生長(zhǎng)速率和致病力等方面存在顯著的多樣性。經(jīng)過(guò)

3、對(duì)其中的30個(gè)菌株進(jìn)行群體菌絲融合群(MCG)的鑒定分析,發(fā)現(xiàn)這30個(gè)菌株可劃分為17個(gè)菌絲融合群。其中9個(gè)菌絲融合群只包含一個(gè)菌株,它們只與自身可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)親和,其余的MCGs包含2至5個(gè)菌株。研究還發(fā)現(xiàn),有些菌株盡管來(lái)自同一莖稈,它們也會(huì)出現(xiàn)菌絲體不融合現(xiàn)象,造成對(duì)同一莖稈的復(fù)合侵染。這些結(jié)果表明即使在很小的范圍內(nèi),核盤菌也存在復(fù)雜的多樣性。
　　 在這83株菌株中,發(fā)現(xiàn)XG36-1菌株與其它菌株在表型上存在顯著的差異。這些差

4、異包括XG36-1菌株生長(zhǎng)緩慢、菌落呈扇型擴(kuò)展、氣生菌絲發(fā)達(dá)、產(chǎn)生菌核數(shù)量較少且不規(guī)則排列于菌落中；在致病力方面,XG36-1菌株幾乎不能在離體油菜葉片上形成病斑,致病力極其微弱。XG36-1菌株的表型與實(shí)驗(yàn)室早期報(bào)道的病毒性弱毒菌株Ep-1pN的類似,是一株弱毒的衰退菌株。為了明確XG36-1菌株的衰退機(jī)理,對(duì)該菌株進(jìn)行了以下的研究:(1)XG36-1菌株的原生質(zhì)體再生子代生物學(xué)特性分析；(2)XG36-1菌株子囊孢子后代的生物學(xué)特性

5、分析；(3)XG36-1菌株衰退特性的傳染性試驗(yàn)；(4)對(duì)XG36-1菌株的細(xì)胞進(jìn)行電子顯微觀測(cè)及病毒粒體的分離；(5)病毒性核酸分離和鑒定分析。發(fā)現(xiàn)XG36-1菌株的原生質(zhì)體再生后代按表型可以分為三種類型,即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等,其中約有25.5％的再生植株屬于Ⅰ型,約23.8％的再生植株屬于Ⅱ型,Ⅲ型再生植株與弱毒菌株XG36-1并沒(méi)有顯著差異,分離頻率為51.7％。共獲得了104個(gè)子囊孢子單孢分離物,它們均具有正常菌株的表型,而與X

6、G36-1菌株有顯著的差異。表明XG36-1菌株具有正常菌株的細(xì)胞核遺傳物質(zhì),其衰退系由非染色體遺傳物質(zhì)所致,而且在細(xì)胞中分布不均勻。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)化了核盤菌正常菌株XG36-1A34,篩選并獲得具正常表型且抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子X(jué)G36-1A34R。將XG36-1菌株與XG36-1A34R進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng),可以自含有潮霉素的PDA平皿中分離到具有XG36-1菌株表型的分離物,表明XG36-1菌株中與衰退相關(guān)的遺傳因子是可以移動(dòng)的,具有傳染

7、特性。透射電鏡顯微觀測(cè)發(fā)現(xiàn)XG36-1菌株中的菌絲細(xì)胞中存在直徑約為40 nm的類似病毒粒體(VLP),XG36-1菌株的子囊孢子單孢分離物的菌絲細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)VLP,一旦與XG36-1菌株接觸后,將獲得出現(xiàn)類似的VLP。采用蔗糖梯度離心的方法可以自XG36-1菌株的菌絲體中分離到少量的VLP。采用纖維素CF-11吸附法自菌絲體中和自純化的病毒粒體中都沒(méi)有成功地分離到病毒的核酸。
　　 而在這83株菌株中也發(fā)現(xiàn)一株XG19-2菌

8、株,它在生長(zhǎng)、菌落形態(tài)、菌核形成和致病等方面與核盤菌正常菌株沒(méi)有顯著差異。但是,采用CF-11吸附法自其菌絲中提取和分離到大小約為4kb左右的dsRNA片段。利用隨機(jī)引物對(duì)該dsRNA片段進(jìn)行了cDNA克降。獲得了2個(gè)陽(yáng)性克隆,將近700多bp,通過(guò)測(cè)序和序列分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)陽(yáng)性克隆均含有一個(gè)不完整的閱讀框。將其推定的編碼的肽鏈進(jìn)行Blastp分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)肽鏈均與真菌病毒Diaporthe ambiguaRNA virus1(DaR

9、V1)的依賴RNA的RNA聚合酶(gdgp)具有較高的同源性。表明XG19-2菌株中的dsRNA實(shí)質(zhì)上是一種未知真菌病毒的基因組,命名這種病毒為核盤菌XG19-2 RNA病毒(Sclerotinia sclerotiorum XG19-2 RNA virus,SsXG19-2RV)。
　　 本研究證實(shí)即使在面積相對(duì)較小的油菜田間核盤菌也具有豐富的多樣性；分離獲得了弱毒菌株XG36-1,并證實(shí)其衰退與感染未知的真菌病毒緊密相關(guān),而

10、且存在于菌株XG36-1病毒粒體較少,但是可以使其致病力嚴(yán)重衰退,所以在評(píng)估其作為生防因子的價(jià)值中有著非常重要的意義。在正常表型的菌株XG19-2中分離和鑒定出一種與DARV1具有顯著親緣關(guān)系的新病毒。而Diaportheambigua RNA virus1是可以使洋梨干枯病病原菌毒力衰退,但是XG19-2中SsXG19-2RV病毒并沒(méi)有對(duì)寄主產(chǎn)生影響,這不僅表明雖然同種真菌病毒可以在多種寄主中存在,而且在和不同的寄主互作方式也不同,所