柑橘速衰病毒的遺傳多樣性研究.pdf

1、由柑橘速衰病毒(CTV)引發(fā)的柑桔速衰病是全世界柑桔生產(chǎn)中破壞力最強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)意義最為重要的病害之一。它主要危害以酸橙作砧木的柑桔，也能引起葡萄柚和某些甜橙品種的莖陷和果實變小等癥狀。本研究應(yīng)用RT-PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、DNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析等方法，目的是要調(diào)查我國柑橘CTV感染的基本情況，比較不同分離物的序列特征，探索CTV的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，最終為開發(fā)分子標(biāo)記鑒定我國CTV株系提供理論指導(dǎo)。結(jié)果如下： 1．以隨機(jī)采

2、樣的方式，從湖北、湖南和江西3省10縣的柑橘產(chǎn)區(qū)收集242份溫州蜜柑、橘、甜橙和柚樣品。對PAS-ELISA法檢測呈陽性的樣品進(jìn)行CTV的CP基因的RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果來自14個樣品采集地的120份樣品感染了CTV，單個采樣點的感染率為20.0％-71.4％，總感染率達(dá)49.6％，表明CTV在這些地區(qū)已經(jīng)廣泛分布。SSCP分析顯示，120份CP基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物共產(chǎn)生120種SSCP譜型，每一種譜型含有2-7條不等的單鏈DNA

3、帶，暗示這些樣品采集地區(qū)存在廣泛的CTV混合感染。以CTAB-LiCl法制備的總RNA為模板，可以對柑橘進(jìn)行CTV的RT-PCR檢測。 該法制備總RNA的過程簡單，成本低廉。 2．以柑橘葉片總RNA為模板，用RT-PCR擴(kuò)增CP基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆與測序證實，來自湖南道縣和江西崇義3份橘的實生苗樣品(HN、JX-1和JX-2)都感染了CTV。通過擴(kuò)增產(chǎn)物克隆前和克隆后的PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)來自HN和Jx-1的CP基因

4、各自只含有1種獨特的序列，來自JX-2的序列則含有2種主要的序列。這表明來自3份樣品的CTV的CP基因不僅存在序列變異，而且樣品JX-2的CTV群體可能因為混合感染而呈異質(zhì)性。 通過雙向測序和序列分析，4個CP基因序列都沒有堿基插入、缺失或終止密碼子插入，含有完整的翻譯區(qū)。核苷酸序列比對分析表明，4個克隆之間的相似性為93％-98％；克隆HN-K與葡萄牙分離物28C、以色列莖陷分離物VT的相似性都達(dá)到98％；克隆JX-1-1與印

5、度莖餡分離物Pune和Bangalore的相似性都在98％以上；克隆JX-2-7、JX-2-17與日本苗黃分離物NUagA和美國加利福尼亞嚴(yán)重莖陷分離物SY568的相似性也在97％-98％之間。4個克隆與佛羅里達(dá)速衰分離物T36、弱毒分離物T30和西班牙弱毒分離物T385的相似性僅有91％-93％。系統(tǒng)樹分析顯示，4個中國克隆分屬3個不同的分支，每個分支由中國克隆和地理來源不同的莖陷或苗黃分離物組成。 3．以SSCP分析顯示CT

6、V混合感染程度較輕的江西省于都縣的1份甜橙樣品為材料 ，通過RT-PCR擴(kuò)增CP基因、p23基因和RdRp 5＇端序列。重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物的SSCP分析結(jié)果顯示，CP基因、p23基因和RdRp5＇端序列都只產(chǎn)牛3-4種不同的SSCP帶型，優(yōu)勢帶型所對應(yīng)的重組質(zhì)粒所占比例基本一致。代表2種不同帶型的CP基因克隆ML-12和ML-13經(jīng)過測序、序列比對和進(jìn)化分析，證實江西于都甜橙的CTV群體是一個至少包含有強(qiáng)毒(莖陷或苗黃)和弱毒2種株系

7、的混合群體。CP基因克隆ML-12和6個強(qiáng)毒分離物如NUagA、SY568和T318A等莖陷或苗黃分離物具有很高的同源性，最大遺傳距離僅有0.073。另一個克隆ML-13與弱毒分離物T385和T30之間只有7個核苷酸和2個氨基酸的差異。p23基因克隆ML-4與5個弱毒分離物之間的核苷酸距離為0.049-0.064。各個克隆或分離物的842bp的RdRp基因5＇端序列之間存在極大的變異性，核苷酸距離最大值高達(dá)0.221，而且遺傳距離的大小

8、與它們的生物學(xué)特性沒有相關(guān)性。另外，在這段序列的中部，發(fā)現(xiàn)一段長17nt、富含AT的保守序列。序列比對結(jié)果表明，除了RdRp基因5＇端序列的變異性太大外，廣泛分布于CP基因和p23基因的保守位點與其生物學(xué)特性具有顯著的一致性。CP基因可以將速衰分離物T36和非速衰分離物如弱毒分離物T30、T385以及莖陷或苗黃分離物NUagA、SY568和T318A區(qū)分開，p23基因也可以作為標(biāo)記物將所有強(qiáng)毒分離物和所有弱毒分離物區(qū)分開。所以，CP基因