中國柑橘炭疽病病原種類及種群遺傳多樣性研究.pdf

1、柑橘炭疽病是柑橘上重要的常發(fā)性病害,為害新梢、葉片、花器、幼果、果梗以及引起貯藏期蒂腐爛果,某些年份在局部地區(qū)會爆發(fā)流行帶來巨大的經(jīng)濟損失。然而國際上有關(guān)柑橘炭疽病的研究并不深入,國內(nèi)的研究更是屈指可數(shù)。本文就我國柑橘炭疽菌屬(Colletotrichum spp.)真菌引起的病原種類,以及優(yōu)勢種群的種群遺傳多樣性開展了研究,獲得如下結(jié)果。
　　 對來自浙江,江西,廣東,福建,湖南,重慶和云南等地不同柑橘類型(品種),不同發(fā)病器

2、官的炭疽病材料進行分離培養(yǎng),獲得220個單孢菌株。依據(jù)在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征和分生孢子的形態(tài),病菌可分為3個類型,A:菌落顏色白色至深青色,變化多樣,生長速率1.2～1.7 cm/天,產(chǎn)生鮮紅色分生孢子堆,孢子呈棍棒狀,兩端鈍圓,大小12.5～18.6×4.7～6.0 lxm;B:菌落灰白色,生長速率0.6～0.8 cm/d,產(chǎn)生淡紅色孢子堆,分生孢子梭形,兩端尖,12.4～14.8×4.1～5.1μm:C:菌落青色,生長速率居于A

3、,B之間,1.0～1.3 cm/d,產(chǎn)生橘黃色分生孢子堆,分生孢子新月形。測定這3個類型菌株的致病性表明:A和C類型菌株均能侵染椪柑(Citrus reticulata)嫩梢、花器和成熟的果實,引起典型的癥狀;而B類型菌株只能感染椪柑的花器,能夠在椪柑的葉片和成熟果實上存活,但不能引起發(fā)病,其寄生具有很強的組織特異性。應(yīng)用膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢炭疽菌C.acutatum的種特異性引物

4、CgInt/ITS4和CaInt/ITS4進行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)引物CgInt/ITS4能從A類菌株擴增到約450bp目標片段,CaInt/ITS4能從B類菌株中擴增到約490bp目標片段,但該兩對引物均不能從C類菌株擴增出片段。選取3種類型部分菌株應(yīng)用通用引物ITS4/ITS5擴增rDNA-ITS區(qū)域,克隆測序結(jié)果在NCBI上比對,發(fā)現(xiàn)A類型菌株(HN-L01,JX-F10,CQ-L03,GD-B15)與膠孢炭疽菌C.Gloeospor

5、ioides(AJ301988,AM947679)同源性為99％,B類型菌株(YN01,YN02,YN-3-16)與C.acutatum(AJ301964,AJ301932)的同源性為99％,C類菌株(XY-01,XY-02)與平頭炭疽菌C.truncatum(AY266380,AJ301944)相似度為99％。綜合國外文獻和本研究結(jié)果,A和B型可確定為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和尖孢炭疽菌C.

6、acutatum;C類型暫定為平頭炭疽菌C.Truncatum,鑒于該病菌尚未在柑橘上發(fā)生和為害的報道,需要作進一步的研究確定。
　　 在獲得的菌株中,C.gloeosporioides占96.3％,分布各個采樣省份,占據(jù)絕對優(yōu)勢:C.acutatum只是從云南瑞麗的萊檬(C.aurantifolia)上發(fā)現(xiàn),占1.4％;而C.truncatum菌株來自云南和廣東,只占2.3％。綜上所述,引起我國柑橘炭疽病的病原有3個,以膠孢炭

7、疽菌為優(yōu)勢種群。
　　 利用5對引物Bt2a/13t2b,GSF1/GSR1,GDF1/GDR1,CL1/CL2,ITS4/ITS5分別擴增β-微管蛋白(beta tubulin-2-gene,BT),谷氨酸合成酶(glutamine-synthetase,GS),三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GDPH),鈣調(diào)蛋白基因(calmoudulin,Cal)和核糖體DNA

8、轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)的部分序列,應(yīng)用軟件MEGA4.0的鄰接法(neighbor-joining method,N-J)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹來研究柑橘上的C.gloeosporioides的群體遺傳變異。
　　 結(jié)果：表明:ITS和BT基因序列都不能有效地揭示出C.gloeosporioides種下的變異水平,來自柑橘的菌株以高相似度聚為一類;Cal,GDPH,GS對揭示C.gloeosporioides群體遺傳變異是有效的,其中C.g

9、loeosporioides群體依Cal序列可聚為Cal-Ⅰ和Cal-Ⅱ兩個亞群,依GDPH可聚為GD-Ⅰ和GD-2Ⅱ兩個亞群,依GS序列聚為GS-Ⅰ,GS-Ⅱ,GS-Ⅲ,GS-Ⅳ共4個亞群。3種基因序列形成的各亞群間在菌株構(gòu)成上有一定的重合性,但又不盡相同。最后將5個基因序列合并后構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示除了豐富的遺傳多樣性,包括Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ,Ⅷ共8個小亞群。其中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ構(gòu)成大亞群Group A,Ⅵ,Ⅶ構(gòu)成另一