紅掌炭疽病病原的鑒定、分子檢測及群體遺傳多樣性研究.pdf

1、本文采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法對紅掌炭疽病的病原進(jìn)行了鑒定；并對紅掌炭疽菌的分子檢測進(jìn)行了研究；同時(shí)建立了毀滅炭疽菌的RAPD-PCR和ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，對紅掌上的5個(gè)毀滅炭疽菌地理群體和1個(gè)膠孢炭疽菌地理群體進(jìn)行了RAPD和ISSR分析。 紅掌炭疽菌的收集與鑒定：從廣州、揚(yáng)州、南京等地采集紅掌炭疽菌，在經(jīng)單孢分離得到的炭疽菌中，存在形態(tài)差異明顯的兩個(gè)群體。每個(gè)群體各選取2個(gè)代表菌株，進(jìn)行形態(tài)特征，致病性，寄主

2、范圍鑒定及核糖體DNA-ITS序列分析。結(jié)果表明：紅掌上有兩種致病菌，膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和毀滅炭疽菌(Colletotrichum destructivum)，后者是首次報(bào)道在紅掌上致病，且發(fā)現(xiàn)為優(yōu)勢種；兩者可單獨(dú)侵染，也可復(fù)合侵染，都具有潛伏侵染的特性。 紅掌炭疽菌的分子檢測：根據(jù)Colletotrichum 33個(gè)種的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITs)序列差異設(shè)計(jì)的兩對種特異性

3、引物E1/E2，F(xiàn)1/ITS4，可以分別特異地從紅掌上的膠孢炭疽菌和毀滅炭疽菌菌株中擴(kuò)增到一條329 bp和486 bp的條帶，而從其它供試菌株中不能擴(kuò)增出該條帶。這兩個(gè)檢測體系對純基因組DNA的擴(kuò)增靈敏度均達(dá)到10pg；將這兩對引物分別與ITS區(qū)通用引物進(jìn)行套式PCR后檢測靈敏度菌均至少可提高10000倍；當(dāng)1g土中達(dá)到200個(gè)分生孢子均可被檢測出；進(jìn)一步利用這兩個(gè)檢測體系對攜帶病原菌的灌溉水、發(fā)病組織進(jìn)行檢測，均能快速穩(wěn)定地檢測出病

4、原菌。 毀滅炭疽菌基因組RAPD，ISSR-PCR體系的建立：對影響PCR反應(yīng)的主要因子：Mg<'2+>、dNTP、Taq酶、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立起適合于毀滅炭疽菌基因組DNA的RAPD和ISSR反應(yīng)體系。RAPD反應(yīng)體系(25μl)：Mg<'2+>濃度2.5mmol/L，dNTP濃度200μmol/L，Taq酶用量1U，引物濃度1μmol/L。ISSR反應(yīng)體系(25μl)為：Mg<'2+>濃度2mmol/L，dNTP濃度15

5、0μmol/L，Taq酶用量0.5U，引物濃度1.25μmol/L。 炭疽菌基因組RAPD和ISSR指紋圖譜分析：采用RAPD和ISSR分析技術(shù)對來自于廣州、南京等地紅掌上的五個(gè)毀滅炭疽菌地理群體和來自廣州紅掌上的一個(gè)膠孢炭疽菌地理群體的DNA指紋圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：11條RAPD引物共擴(kuò)增出155條條帶，其中多態(tài)性條帶比例為96.13％而10條ISSR引物擴(kuò)增出101條條帶，多態(tài)性條帶比例為98.02％。無論是RAPD還