大鯢虹彩病毒病病原的分離、鑒定、基因組測序及大鯢群體遺傳多樣性分析.pdf

1、大鯢（Chinese giant salamander，Andrias davidianus）是我國重要的珍稀保護(hù)動物與特種養(yǎng)殖對象。近年來，隨著大鯢養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高以及苗、種交流的日益頻繁，大鯢的病害問題日益突出。大鯢虹彩病毒病作為新出現(xiàn)的病毒性疾病，對大鯢養(yǎng)殖業(yè)危害十分嚴(yán)重，已經(jīng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對大鯢虹彩病毒病的病原進(jìn)行了分離、鑒定，分析了病毒的理化特性，建立了病毒的檢測方法，并且對病毒的基因組

2、進(jìn)行了測序及分析。同時，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對大鯢群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴大鯢虹彩病毒病病原的分離、鑒定。從全身水腫，腹部有出血點的幼鯢以及全身性體表出血、吻端或四肢末端潰爛的成鯢體內(nèi)成功分離到一株病毒。對感染組織進(jìn)行病理切片發(fā)現(xiàn)，患病大鯢腎臟、肝臟、脾臟和腸道受損明顯，肝組織脆性增加、表面多出血點，腎臟細(xì)胞空泡變性;脾縮小，淋巴細(xì)胞減少且壞死，并在其內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似病毒的包涵體。病變組織的過濾勻漿液可使鯉魚上皮

3、瘤細(xì)胞(EPC)產(chǎn)生病變;對感染的組織和出現(xiàn)病變的EPC細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果表明，細(xì)胞的線粒體變形，嵴斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核破碎，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有空泡，并且可見晶格狀排列、直徑約140nm具典型虹彩病毒形態(tài)學(xué)特征的病毒粒子。人工回歸感染實驗表明，該病毒導(dǎo)致健康大鯢出現(xiàn)與自然發(fā)病大鯢相同的癥狀，表明其為致病病原;克隆病毒主衣殼蛋白基因(MCP)全序列并進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示該序列與虹彩病毒科蛙病毒屬病毒的相似性在98％以上。結(jié)合組

4、織病理、細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡觀察、感染試驗以及分子生物學(xué)鑒定，證明導(dǎo)致大鯢患病的病原為虹彩病毒科蛙病毒屬病毒，命名為大鯢虹彩病毒(Chinesegiant salamander iridovirus, GSIV)。
　　 ⑵大鯢虹彩病毒理化與生物學(xué)特性研究及檢測方法建立。采用常規(guī)的病毒理化與生物學(xué)特性研究方法，對該病毒的培養(yǎng)滴度、病毒對熱、酸堿度、有機(jī)溶劑、胰蛋白酶的敏感性以及病毒增殖特性與最適培養(yǎng)溫度等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，大鯢虹彩

5、病毒的病毒滴度TCID50/0.1mL為109.85±0.48;病毒對pH3和10的酸、堿敏感;在56℃熱處理30min后病毒被滅活;胰蛋白酶處理后病毒滴度顯著下降;在25℃條件下病毒在EPC細(xì)胞中增殖迅速，在感染細(xì)胞6h后病毒開始增殖，72h后進(jìn)入平臺期。病毒的理化性質(zhì)與已知虹彩病毒理化特性相符。針對病毒MCP基因，分別建立了普通PCR、巢氏PCR、熒光定量PCR、多克隆抗體和環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(LAMP)共5種檢測方法，通過對5種檢測

6、方法各自反應(yīng)條件的優(yōu)化以及對不同來源病毒進(jìn)行檢測驗證，結(jié)果證明這5種方法都可以有效地檢測大鯢虹彩病毒，可以作為大鯢虹彩病毒病原的檢測方法。其中，熒光定量PCR和LAMP法檢測的靈敏度高達(dá)10-9模板DNA稀釋度，可以對微量病毒進(jìn)行檢測。
　　 ⑶大鯢虹彩病毒全基因組測序及序列分析。基于De Novo測序技術(shù)，利用Illumina公司的HiSeq基因組分析儀(IlluminaHiSeq2000)對大鯢虹彩病毒進(jìn)行全基因測序。測序結(jié)

7、果顯示病毒基因組全長104373bp，GC含量為55.2％，有95個開放閱讀框（ORFs），編碼蛋白所含的氨基酸個數(shù)從49到1294個不等，分子量大小在5.2～140.9 kDa之間;在基因組40219～40314nt位置有48個CA重復(fù)序列;將大鯢虹彩病毒基因組的ORFs與其它已知虹彩病毒基因組的ORFs進(jìn)行比較顯示，大鯢虹彩病毒病毒基因組有41個ORFs與普通產(chǎn)婆蟾蛙病毒(common midwife toad ranavirus，

8、CMTV)最為相似，而且基因組點陣分析也顯示大鯢虹彩病毒基因組與CMTV病毒最為相似。將大鯢虹彩病毒的26個核心基因與15株已知虹彩病毒基因組的26個核心基因進(jìn)行比較，按照大鯢虹彩病毒編碼蛋白的氨基酸排列順序進(jìn)行串聯(lián)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹結(jié)果顯示虹彩病毒各屬成員分別聚類，感染同類宿主的病毒成員有聚在一起的趨勢;大鯢虹彩病毒與蛙病毒屬成員聚在一類，且與CMTV病毒關(guān)系最近。
　　 ⑷大鯢微衛(wèi)星引物開發(fā)及遺傳多樣性分析。利用磁珠富