贛南地區(qū)柑橘衰退病毒遺傳多樣性及基因型分析.pdf

1、衰退病是柑橘上最具毀滅性的病毒性病害之一，已導(dǎo)致全世界多個(gè)柑橘主產(chǎn)區(qū)的柑橘樹(shù)死亡。柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）主要通過(guò)感病接穗嫁接和蚜蟲(chóng)取食進(jìn)行傳播，全基因組包含12個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORF6編碼的外殼蛋白覆蓋了病毒粒子約95％的全基因組，其與CTV致病力相關(guān)且是病毒裝配過(guò)程中所必須的。CTV還存在明顯的株系分化，并可分為多種基因型。根據(jù)CTV在寄主上表現(xiàn)不同感病癥狀可分為苗黃型、莖陷點(diǎn)型、速衰型三

2、種分離株類(lèi)型；根據(jù)CTV全基因組序列差異還可將CTV劃分為七種基因型。本研究調(diào)查了贛南柑橘果園的衰退病發(fā)病情況；通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)感染CTV的樣品擴(kuò)增目的片段并克隆測(cè)序，進(jìn)行遺傳多樣性分析；利用兩類(lèi)基因型鑒定引物分析樣品的基因型，并對(duì)部分樣品進(jìn)行片段克隆測(cè)序和序列分析遺傳，明確贛南地區(qū)CTV分離株的遺傳多樣性和基因型組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1、在江西贛南15個(gè)縣（市、區(qū)）的柑橘果園以隨機(jī)采樣的方式，收集了351份品種均為紐荷

3、爾的柑橘樣本，抽提樣本總RNA進(jìn)行CTV的CP（Coat protein, CP）基因RT-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)顯示，有175份樣品感染CTV，單個(gè)采樣點(diǎn)的感染率在39.3%～69.3%，平均感病率在49.85%，結(jié)果表明柑橘衰退病在贛南地區(qū)的柑橘果園普遍發(fā)生。
　　2、隨機(jī)選取78份陽(yáng)性樣本擴(kuò)增CTV的CP基因并克隆測(cè)序，分析序列基因重組和堿基含量，并將所測(cè)序列與10個(gè)致病性不同的國(guó)外CTV分離株進(jìn)行核苷酸遺傳距離、序列同源

4、性和系統(tǒng)進(jìn)化分析。分析可知：采自江口編號(hào)為JK4的樣品在35～490nt區(qū)域之間存在基因重組，該重組事件被5種運(yùn)算法則檢測(cè)到，P值在3.746×10-4～1.811×10-2之間；78份樣品的平均GC含量為52.8%，AT（U）含量為47.2%，平均堿基含量GC＞AT；78份樣品CP基因核苷酸遺傳距離在0.000～0.072，與10個(gè)國(guó)外CTV分離株遺傳距離在0.005～0.106；樣品的CP基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為94.7%

5、～100%，92.3%～100%，與10個(gè)國(guó)外CTV分離株的分別為76.5%～84.1%，73.6%～80.3%；系統(tǒng)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)采自同一地點(diǎn)的樣品在聚類(lèi)樹(shù)上分處于不同組群且分支遠(yuǎn)近不同，部分樣品與國(guó)外莖陷點(diǎn)型和衰退型CTV分離株聚為一支，它們序列相似性相對(duì)較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明贛南地區(qū)CTV分離株CP基因保守性較高，序列存在一定程度的變異，各采樣點(diǎn)的CTV分離株之間親緣性較高但與國(guó)外CTV分離株之間親緣性相對(duì)偏低，大部分贛南地區(qū)的樣

6、品可能存在混合侵染現(xiàn)象。
　　3、分別利用Hilf、Roy設(shè)計(jì)的引物鑒定135份樣品的基因型。Roy的引物鑒定顯示：有43份樣品為單基因型，基因型分別為VT、T3、B165，均由強(qiáng)毒型分離株組成；41份樣品的基因型混合了兩種分離株，其中有5份由強(qiáng)弱毒分離株混合，36份由強(qiáng)毒分離株混合；基因型包含三種分離株的樣品中，有4份基因型為VT+T3+T36，剩余4份基因型混合了強(qiáng)弱毒分離株；基因型混合四種分離株的樣品有8份，其中2份為VT+

7、T3+T36+B165組合，6份為VT+T3+T30+T36組合；還有35份樣品無(wú)法判斷基因型。Hilf的引物鑒定顯示：有44份樣品為單基因型，也均由強(qiáng)毒型分離株組成，其中最多的是VT基因型，其次為T(mén)36基因型，T3基因型較少；有35份樣品的基因型包含了兩種分離株，基因型均由強(qiáng)毒型分離株組成的有兩種：VT+T36和VT+T3，這兩種基因型樣品有25份，剩余10份樣品基因型混合了強(qiáng)弱毒分離株；8份樣品的基因型包含三種分離株，其中有4份為V

8、T+T3+T36組合，3份為VT+T30+T3組合，T3+T30+T36組合的樣品僅1份；有一份樣品的基因型包含了4種分離株；還有47份樣品無(wú)法鑒定基因型。結(jié)合兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：贛南地區(qū)存在VT、T3、T30、T36和B165五種基因型；其中大部分樣品基因型包含多種分離株，基因型組合復(fù)雜多樣；VT分離株在樣品的基因型中出現(xiàn)的頻率最高，基因型組合為VT+T3、VT+T36的樣品較多；部分樣品利用兩類(lèi)引物鑒定基因型結(jié)果不一致，還有部分樣品利

9、用兩類(lèi)引物均無(wú)法鑒定基因型。
　　4、分別選取了9份用兩類(lèi)引物鑒定結(jié)果相同和不同的樣品，利用Hilf的引物擴(kuò)增樣品的目的片段并克隆測(cè)序，分析其遺傳信息。結(jié)果表明：5’、k17序列發(fā)育樹(shù)中，與參考分離株聚為一支或一組的樣品通過(guò)兩類(lèi)引物鑒定均顯示基因型包含相應(yīng)的參考分離株，它們之間序列相似性較高，遺傳距離也較近；多份樣品通過(guò)兩類(lèi)引物鑒定基因型均顯示包含某種分離株但并沒(méi)有與相應(yīng)的參考分離株聚為一組，它們之間序列相似性較低，遺傳距離也較遠(yuǎn)