13337.過氧亞硝酸根對p53中酪氨酸硝化作用及對其活性影響的研究

1、UDC：577中文圖書分類號：Q5學(xué)校代碼：10005學(xué)號：$201015026密級：公開北京工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文題目：過氧亞硝酸根對p53中酪氨酸硝化作用及對其活性影響的研究英文題目：RESEARCHONTHETYROSINENITRATIONINP53INDUCEDBYPEROXY卜ⅡTIUTEINANDITSACTIVITY論文作者：學(xué)科：研究方向：申請學(xué)位：指導(dǎo)教師：所在單位：答辯日期：授予學(xué)位單位：丁楊生物化學(xué)與分子生物學(xué)

2、化學(xué)生物學(xué)與分子醫(yī)學(xué)理學(xué)碩士羅云敬教授生命科學(xué)與生物工程學(xué)院2013年6月北京工業(yè)大學(xué)摘要摘要p53蛋白在人體內(nèi)是由TP53基因編碼的一種腫瘤抑制蛋白，它在細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和遺傳穩(wěn)定性等生理過程中起重要的作用。p53蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞停止分裂，并激活DNA修復(fù)蛋白，同時，它能夠啟動細(xì)胞的程序性死亡，故又稱為“基因組的守護(hù)者”。p53蛋白功能的缺失或結(jié)構(gòu)的損壞會使其喪失對細(xì)胞周期的調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞的無限分裂，

3、最終形成腫瘤。過氧亞硝酸根離子(ONOO)是生物體內(nèi)由一氧化氮自由基(’NO)和超氧陰離子(02“)快速結(jié)合生成的一種細(xì)胞毒性物質(zhì)。生理?xiàng)l件下ONOO‘能夠質(zhì)子化為過氧亞硝酸(ONOOH)從而穿越細(xì)胞膜，其強(qiáng)大的氧化和硝化能力可導(dǎo)致生物大分子包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的損傷。其中蛋白質(zhì)酪氨酸的硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，可以使蛋白質(zhì)變性并產(chǎn)生一系列的細(xì)胞毒性作用從而誘發(fā)疾病。可見，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化有著重要的生理、病理學(xué)

4、影響。本研究以p53蛋白為目標(biāo)分子，以O(shè)NOO’為誘導(dǎo)劑，結(jié)合生物體內(nèi)微環(huán)境，應(yīng)用電泳儀、紫外可見分光光度計(jì)、高效液相色譜和質(zhì)譜等現(xiàn)代分析儀器，運(yùn)用WesternBlot、分子動力學(xué)模擬等手段研究了ONOO一對p53蛋白結(jié)構(gòu)的改變以及其在翻譯后修飾水平的上造成的損害。首先通過重組質(zhì)粒及大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備了GSTp53融合蛋白，并且經(jīng)過谷胱甘肽凝膠層析柱對融合蛋白進(jìn)行了提純分離。人重組P53蛋白的表達(dá)制備有著重要的應(yīng)用價值。純化的G

5、STp53融合蛋白為之后的研究和實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。其次采用高效液相色譜電噴霧離子阱質(zhì)譜(HPLCESIITMS)方法研究了ONOO。介導(dǎo)的p53蛋白酪氨酸硝化的反應(yīng)過程和選擇性。通過對硝化濃度和反應(yīng)體系的生理模擬，液質(zhì)聯(lián)用體系的條件優(yōu)化，使蛋白質(zhì)殘基識別覆蓋率達(dá)到了85％，識別出9個酪氨酸中的6個，并鑒定出其優(yōu)先硝化位點(diǎn)為Zyrl07，Tyrl63，Tyr327。然后通過WesternBlot驗(yàn)證了ONOO一對p53蛋白的活性損傷并得出O

6、NOO一的濃度在10mM級時即可使p53蛋白失去活性。最后，在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，對p53蛋白的硝化產(chǎn)物進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬，來闡明3硝基酪氨酸的產(chǎn)生對p53蛋白的二級結(jié)構(gòu)的影響，并對p53蛋白中酪氨酸的硝化選擇性進(jìn)行了推理解釋。Tyrl07受附近負(fù)電性和疏水性氨基酸殘基的影響而易被硝化，Tyrl63與Ar9249形成的no共軛和空間疏水位，Tyr327殘基的暴露都使它們成為容易被硝化的位點(diǎn)。硝化后的Tyrl07、Tyrl63、Tyr32