西爾斯山羊草和雙角山羊草高分子量麥谷蛋白亞基基因的分子克隆.pdf

1、由于高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)在普通小麥加工品質(zhì)中的重要作用而被廣泛重視和從多個(gè)角度進(jìn)行深入研究。通過對(duì)普通小麥HMW-GS的分析可以看出，普通小麥中HMW-GS類型，尤其是與優(yōu)質(zhì)密切相關(guān)的亞基類型較少，遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)面粉品質(zhì)的要求，而小麥野生近緣種的HMW-GS組成都表現(xiàn)豐富的多樣性，其中與小麥屬親緣關(guān)系密切的山羊草屬(AegilopsL.)更備受矚目。因此，尋找新的優(yōu)質(zhì)HMW-GS類型隨之成為小麥品種品質(zhì)改良十分重要的研

2、究領(lǐng)域。 研究以山羊草屬二倍體Sitopsis組中Ae.speltoides(SsSs)，Ae.searsii(SseSse)，Ae.bicornis(SbSb)，Ae.sharonensis(SshSsh)和Ae.longissima(S1S1)五個(gè)種為材料，通過SDS-PAGE分離和鑒定HMW-GS的組成和多態(tài)性；應(yīng)用兼并性引物，基因組PCR擴(kuò)增Ae.searsii和Ae.bicornis中的HMW-GS開放閱讀框(ORFs)和

3、5′端啟動(dòng)子序列，利用定向缺失技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆和測(cè)序，獲得一系列HMW-GS的全基因序列，在大腸桿菌BL21中成功進(jìn)行成熟蛋白的體外表達(dá)和分離，并通過Westernblot的驗(yàn)證。 研究結(jié)果表明，AegilopsSitopsis組中所有的供試材料，均含有高分子量谷蛋白亞基基因位點(diǎn)，分別編碼x-和y-型兩條HMW-GS，HMW-GS組成呈多態(tài)性分布。 根據(jù)AegilopsSitopsis組的高分子量谷蛋白亞基在SDS-PAGE中的

4、電泳遷移率，從Ae.searsii和Ae.bicornis中分別克隆出4個(gè)x-和y-型高分子量谷蛋白亞基基因序列，與普通小麥中的HMW-GS基因序列相比較有較高的同源性，沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，完整的開放閱讀框內(nèi)均包括信號(hào)肽、N-端、C-端和中央重復(fù)區(qū)四個(gè)部分，分子量的差異主要田中央重復(fù)區(qū)的長(zhǎng)度決定?？寺〉腍MW-GS基因符合典型的x-型(N-端含有3個(gè)半胱氮酸殘基，C-端含有1個(gè)半胱氨酸殘基)和y-型HMW-GS(N-端含有5個(gè)半胱氨酸殘基，

5、C-端和中央重復(fù)區(qū)末端均含有一個(gè)半胱氨酸殘基)的半胱氨酸殘基特征。Ae.searsii和Ae.bicornis與普通小麥的HMW-GS基因的5′端上游1100bp左右的啟動(dòng)子區(qū)，核苷酸序列同源性達(dá)96％，主要差異是單個(gè)核苷酸堿基的變化和短核苷酸序列的缺失與插入。HMW-GS的啟動(dòng)子區(qū)均含有“TATA-box”和“cereal-box”結(jié)構(gòu)，符合禾谷類儲(chǔ)藏蛋白啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征。 從Ae.searsii中克隆的49077-x是一個(gè)新型的

6、HMW-GS，比典型的x-型HMW-GS在其中央重復(fù)區(qū)C-端有一個(gè)額外的半胱氨酸殘基，具有優(yōu)質(zhì)HMW-GS(1Dx5)結(jié)構(gòu)的基本特征。49077-x的C-端和中央重復(fù)區(qū)C-端氨基酸序列和模序(motif)類型同v-型HMW-GS相似，與49077-y有159個(gè)氨基酸殘基的完全相同，可能是編號(hào)IG49077的西爾斯山羊草(Ae.searsii，SseSse)在進(jìn)化過程中由于部分基因序列缺失/替換造成的，而49077-x在小麥面粉品質(zhì)中的作

7、用有待于通過體外揉面試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因工作更進(jìn)一步的研究。從Ae.bicornis中克隆的Y52-y是一個(gè)分子量高于普通小麥已知y-型亞基的新型HMW-GS，中間重復(fù)區(qū)具有18個(gè)連續(xù)六肽加九肽組合的結(jié)構(gòu)，這一特征在已發(fā)表的其它y-型HMW-GS中沒有出現(xiàn)。 HMW-GS保守區(qū)核苷酸和氨基酸序列的同源性分析表明，二倍體AegilopsSitopsis組的HMW-GS與普通小麥中的HMW-GS間同源性高，僅存在個(gè)別堿基或核苷酸的插入、缺失和替