春小麥高分子量谷蛋白12亞基基因克隆及積累調(diào)控研究.pdf

1、小麥高分子量谷蛋白是小麥胚乳中主要貯存蛋白。高分子量谷蛋白的組成、數(shù)量和積累與小麥品質(zhì)關(guān)系密切。研究以亞基類型均為2+12而加工品質(zhì)差異明顯的兩個(gè)春小麥品種東農(nóng)7742和新克旱9為材料，克隆高分子量谷蛋白(HMW-G)12亞基基因及其5上游調(diào)控序列，研究兩個(gè)品種籽粒灌漿期谷蛋白亞基積累和12亞基mRNA表達(dá)，從分子水平探討轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控對(duì)亞基積累的影響?！　DS-PAGE凝膠電泳表明，兩個(gè)品種高分子量谷蛋白亞基均在籽粒形成過程中逐漸形

2、成，并隨籽粒灌漿進(jìn)程亞基類型逐漸增多，亞基一旦形成，在以后胚乳發(fā)育過程中不再消失。東農(nóng)7742高分子量谷蛋白亞基在開花后10天開始出現(xiàn)，14天亞基全部形成，新克旱9相應(yīng)為12和18天，比東農(nóng)7742亞基形成晚2-4天。籽粒形成初期高分子量谷蛋白亞基積累量少，隨籽粒灌漿谷蛋白亞基積累漸增。兩個(gè)品種均在開花后20天亞基積累速度加快，最快積累出現(xiàn)在開花后22-26天，但東農(nóng)7742亞基積累速度和積累總量明顯高于新克旱9?！　±肦T-PCR

3、方法研究小麥籽粒灌漿期高分子量谷蛋白12亞基基因mRNA表達(dá)水平結(jié)果表明，東農(nóng)7742的12亞基在開花后第六天出現(xiàn)mRNA的表達(dá)(積累)，花后14天表達(dá)(積累)量最高。新克旱9mRNA的表達(dá)出現(xiàn)在開花后第10天，18天表達(dá)量達(dá)最高。在籽粒灌漿的各個(gè)時(shí)期，東農(nóng)7742的12亞基基因mRNA表達(dá)量均明顯高于新克旱9。12亞基基因mRNA的高表達(dá)可能是東農(nóng)7742的12亞基蛋白積累量高的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控可能是亞基積累的主要調(diào)控方式

4、。　　利用PCR的方法克隆春小麥東農(nóng)7742和新克旱9兩個(gè)品種高分子量谷蛋白12亞基基因的全序列，分別命名pHG12DN和pHG12XKH(已在Genbank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)分別為AY486484和AY486485)。序列長度為1980bp，有四處堿基差異，導(dǎo)致一處氨基酸的變化。東農(nóng)7742與文獻(xiàn)報(bào)道的“中國春”序列同源性分別為99.5％，有10處堿基差異，存在兩個(gè)氨基酸的缺失和一個(gè)氨基酸的替換。新克旱9與文獻(xiàn)報(bào)道的序列同源性為99.6％

5、，有7處堿基差異，但只有兩個(gè)氨基酸缺失。目前尚不能確定氨基酸缺失和替換如何影響亞基的蛋白結(jié)構(gòu)和特性，但東農(nóng)7742、新克旱9和中國春(ChineseSpring)高分子量谷蛋白12亞基基因的克隆及詳細(xì)的核苷酸和氨基酸序列分析，表明品種間存在差異，為通過原核表達(dá)和蛋白純化對(duì)兩種蛋白的特性進(jìn)一步的研究提供可能和基礎(chǔ)。　　克隆的春小麥東農(nóng)7742和新克旱9高分子量谷蛋白12亞基基因全序列已在Genbank上注冊(cè)(注冊(cè)號(hào)分別為AY486484

6、和AY486485)　　設(shè)計(jì)簡并引物通過PCR擴(kuò)增，克隆長為917bp和919bp的東農(nóng)7742和新克旱9高分子量谷蛋白12亞基基因的上游調(diào)控序列。該序列存在一個(gè)TATA-box序列、三個(gè)CAAT-likebox序列，兩個(gè)GCN4motif和一個(gè)E-box及兩個(gè)E-likebox，推測(cè)GCN4motif和E-box與小麥胚乳的特異性表達(dá)有關(guān)。另外，在476-499bp處存在一個(gè)24bp的cerealbox，該序列與禾谷類作物的一300

7、元件同源性很高，在677-714bp處有一個(gè)38bp的HMWenhancer，該序列為高分子量谷蛋白啟動(dòng)子中一段高度保守區(qū)域。上述兩個(gè)區(qū)域可能與高分子量谷蛋白基因表達(dá)量有關(guān)?？寺〉膬蓚€(gè)12亞基基因上游調(diào)控序列為進(jìn)一步通過缺失分析和定點(diǎn)突變研究啟動(dòng)子的功能創(chuàng)造了條件?！　∈状慰寺￠L為917bp和919bp的東農(nóng)7742和新克旱9的12亞基基因的兩個(gè)上游調(diào)控序列，分別命名為pHG12DN-LP和pHG12XKH-LP(已在Genbank注