我國(guó)地方品系雞群中ALV的流行病學(xué)調(diào)查及ALV-K生物學(xué)特性的研究.pdf

1、禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）α反轉(zhuǎn)錄病毒屬（Alpharetrovirus）的一類病毒。ALV感染不僅誘發(fā)多種腫瘤性疾病，還可引起大多數(shù)感染雞的亞臨床癥狀，如產(chǎn)蛋下降、免疫抑制或生長(zhǎng)遲緩。根據(jù)病毒中和試驗(yàn)和gp85的特性，迄今為止將ALV分為A-J十個(gè)亞群，以及新鑒定的K亞群。自20世紀(jì)90年代以來，禽白血病特別是J亞群禽白血病病毒（ALV-J）給我國(guó)的

2、養(yǎng)雞業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害我國(guó)白羽肉雞、蛋用型雞、黃羽肉雞和固有的地方品種雞等各種類型雞的健康發(fā)展。先天垂直感染是ALV的重要傳播方式。由于宿主對(duì)ALV難以產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答反應(yīng)，加之ALV基因組變異頻率較快，至今為止，尚未有商品化的疫苗可用。由于ALV亞群的多樣性，感染和傳播的復(fù)雜性，給我國(guó)的養(yǎng)雞業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，本研究對(duì)我國(guó)不同雞群進(jìn)行了ALV的流行病學(xué)調(diào)查，并對(duì)公雞精液在ALV傳播中作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究；通過研究不同

3、佐劑及免疫增強(qiáng)劑對(duì)ALV-J gp85重組蛋白誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，從而加速和輔助我國(guó)ALV的凈化；對(duì)新分離到的ALV-K全基因組做了系統(tǒng)的分析，并研究了ALV-K的原型株JS11C1對(duì)SPF雞的致病性；本研究利用反向遺傳操作技術(shù)，構(gòu)建JS11C1株的感染性克隆，并在此基礎(chǔ)上首次構(gòu)建了env(J)-LTR(K)和env(K)-LTR(J)的嵌合感染性克隆，借以探究env基因在ALV-K的致病性中所發(fā)揮的作用。
　　1.我國(guó)不同雞群中AL

4、V的流行病學(xué)調(diào)查及其準(zhǔn)種分析
　　本研究對(duì)我國(guó)12個(gè)不同地方品系雞群中ALV進(jìn)行了分離鑒定，共分離鑒定到14株ALV，對(duì)這些分離毒株gp85基因進(jìn)行了克隆測(cè)序和亞型鑒定，結(jié)果顯示有2株ALV-A，1株ALV-B，8株ALV-J和3株ALV-K。其中，2012年從山東某地方品系雞群發(fā)生疑似為血管瘤的腫瘤病例中分離到5株 J亞型 ALV-J，定名為SDLY1201-SDLY1205。分別擴(kuò)增五株ALV-J的gp85基因，并對(duì)五個(gè)毒株準(zhǔn)

5、種多樣性進(jìn)行分析和比較。結(jié)果顯示：五個(gè)毒株其 gp85核苷酸長(zhǎng)度分別為921bp、921bp、924bp、918bp、912bp，其不同克隆之間的氨基酸同源性分比為99.3％-100%、99.3%-100%、99.4%-100%、98.4%-100%、99.0%-100%，其中序列完全相同的克隆比例分別為13/20、17/20、17/20、9/18、16/19，代表了五個(gè)毒株中優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種的比例，對(duì)五個(gè)毒珠優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種的gp85比較顯示其氨基酸

6、同源性為89.2%-92.5%。本研究證實(shí)即使在同一時(shí)期同一雞群感染的不同個(gè)體中，ALV-J野毒株準(zhǔn)種也存在巨大的差異，特別是其中優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種發(fā)生了改變。
　　2.公雞精液在ALV傳播中的作用
　　長(zhǎng)期以來，對(duì)ALV感染雞群過程中公雞的作用特別是對(duì)后代的傳播作用一直沒有得到明確的闡述。本研究通過雞胚靜脈接種J亞群禽白血病病毒（ALV-J），獲得持續(xù)病毒血癥的公雞，并將這些公雞的精液人工授精給產(chǎn)蛋期的母雞，1周后收集種蛋并孵化出雛

7、雞。結(jié)果顯示，兩只受精的母雞在4-5w時(shí)產(chǎn)生ALV-J的抗體，在6只母雞的泄殖腔中檢測(cè)到p27抗原，母雞產(chǎn)的26個(gè)雞蛋中檢測(cè)到3個(gè)蛋清P27為陽性。此外，對(duì)12只母雞進(jìn)行病毒分離時(shí)發(fā)現(xiàn)，在授精后6w均沒有檢測(cè)到病毒血癥的存在。然而，1周齡時(shí)從34只后代的雛雞中的1只雛雞中分離到ALV-J，其與從公雞精液樣品中分離到的ALV-J的gp85基因的序列同源性為98.4％-99.2％。我們的研究表明，ALV-J可以通過公雞的精液的人工授精感染母

8、雞并且垂直傳播給子代的雛雞。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于改進(jìn)和完善種雞場(chǎng)ALV凈化程序有重要的指導(dǎo)作用。
　　3.不同佐劑及免疫增強(qiáng)劑對(duì)ALV-J gp85重組蛋白誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的研究
　　原核表達(dá)的ALV-J gp85囊膜蛋白能夠誘導(dǎo)SPF雞產(chǎn)生抗體，但抗體陽性率和抗體水平均較低，本研究觀察了免疫增強(qiáng)劑松花粉多糖（TPPPS）聯(lián)合不同佐劑（CPG、YF01）對(duì)增強(qiáng)ALV-J gp85囊膜蛋白免疫后抗體水平的影響。結(jié)果顯示，單一gp85重組蛋

9、白只能誘導(dǎo)少數(shù)雞產(chǎn)生抗體，且產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低、維持時(shí)間較短；而YF01或CpG佐劑分別聯(lián)合重組蛋白能夠使大部分免疫雞產(chǎn)生抗體，且效價(jià)較高，當(dāng)兩種佐劑再聯(lián)合使用免疫增強(qiáng)劑泰山松花粉多糖后能夠使產(chǎn)生的高效價(jià)抗體維持時(shí)間更長(zhǎng)。對(duì)ALV-J抗體水平較高的4組收集種蛋進(jìn)行孵化檢測(cè)母源抗體，人工攻毒后觀察母源抗體對(duì)雛雞的保護(hù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)添加免疫增強(qiáng)劑TPPPS組產(chǎn)生的母源抗體水平較沒有添加組高，且對(duì)雛雞具有較高的保護(hù)效力，與對(duì)母體的使用效果

10、一致。通過本研究我們可以發(fā)現(xiàn)泰山松花粉多糖聯(lián)合使用YF01和CPG佐劑可以增強(qiáng)gp85重組蛋白的免疫原性，產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用，這將為開發(fā)更加有效的ALV-J亞單位疫苗提供有力實(shí)驗(yàn)依據(jù)，高效亞單位疫苗的研制也將為J亞群禽白血病的凈化提供更大的幫助。
　　4.K亞群ALV的全基因組分析及其致病性研究
　　本研究從我國(guó)地方品系雞群中分離鑒定到了3株ALV-K，并對(duì)其做了全基因組分析，結(jié)果表明，這3株ALV-K與之前已發(fā)表的AL

11、V-K毒株位于一個(gè)單獨(dú)的分支，與雞群中其他已知亞群的ALV均不在同一分支中。其中，與SDAUAK-11、SDAUAK-12和SDAUAK-13的全基因序列同源性最高的分別為中國(guó)廣東分離株 GD14LZ，GDFX0601，江蘇分離株JS11C1，與其它ALV-K毒株的同源性分別為90.8%-97.7%，90.8%-97.7%，91.2%-97.3%。為研究ALV-K的致病性，將2011年分離自中國(guó)某地方品系雞的ALV-K原型株JS11C1

12、株分別采用卵黃囊接種、雞胚靜脈接種和1日齡腹腔接種三種方式感染SPF雞，系統(tǒng)記錄分析了感染雞群的病毒血癥和抗體產(chǎn)生動(dòng)態(tài)、對(duì)感染雞群體重增重的抑制以及感染雞群對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的影響等方面，以對(duì)JS11C1的致病性進(jìn)行全面評(píng)估。結(jié)果表明，當(dāng)通過卵黃囊接種和雞胚靜脈接種時(shí)，JS11C1可以誘發(fā)感染雞的持續(xù)病毒血癥，抑制感染雞群的體重增重和對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答，并可誘發(fā)一定比例的淋巴細(xì)胞腫瘤。相對(duì)于其他亞群ALV，JS11C1的傳播效率和致病性相對(duì)較

13、弱。本研究系統(tǒng)研究了JS11C1株對(duì)SPF雞的致病性，為下一步研究其致病機(jī)制和科學(xué)防控奠定了基礎(chǔ)。
　　5.env基因在ALV-K致病作用中的研究
　　在所有亞群ALV中，ALV-J致病性最強(qiáng)，而ALV-K與ALV-A、B等類似。為了闡明env基因和LTR片段在ALV-J與ALV-K致病性差異的作用，本研究構(gòu)建和比較了ALV-J野毒株SDAU1005和ALV-K野毒株JS11C1及其重組嵌合病毒renv(J)-LTR(K)和

14、renv(K)-LTR(J)的感染性克隆的生物學(xué)特性。在這4個(gè)感染性克隆病毒中,rSDAU1005（ALV-J）在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制能力最強(qiáng)，rJS11C1最弱，而2個(gè)重組病毒介于二者之間，其強(qiáng)度次序rSDAU1005＞renv(K)-LTR(J)＞renv(J)-LTR(K)＞rJS11C1。此外，在與致病性相關(guān)的對(duì)增重、對(duì)法氏囊和胸腺發(fā)育及疫苗免疫后抗體反應(yīng)的抑制作用上，這一比較結(jié)果表明，env基因和LTR片段在影響ALV-J與A