濟(jì)南大學(xué)畢業(yè)論文封面模板專用

1、<p><b>　　課程設(shè)計(jì)</b></p><p>　　題 目 抗菌肽的合成方法與生物活性綜述 </p><p>　　學(xué) 院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 </p><p>　　專 業(yè) 制藥工程 </p><p>　　班 級(jí)

2、 1204 </p><p>　　學(xué) 生 唐紅東 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 20122721188 </p><p>　　http://www.bz96.com/</p><p>　　填寫日期：二〇一五年十二月二十一日杭州辦證</p><p>　

3、　抗菌肽的合成方法與生物活性綜述</p><p><b>　　唐紅東</b></p><p>　?。?濟(jì)南大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 250200） </p><p>　　摘要： 抗菌肽最早是指昆蟲體內(nèi)經(jīng)過誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一種有抗菌活性的多肽物質(zhì)，分子量通常在2000～7000左右，由20～60個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。這一類型活性多肽大多具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)

4、定性和廣譜抗菌等特點(diǎn)，更因其具有包括抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、癌細(xì)胞等多種生物在內(nèi)的活性，且很難產(chǎn)生抗藥性，所以應(yīng)用前景十分廣闊。本文概述了抗菌肽的分類、結(jié)構(gòu)特征、生物活性、作用機(jī)制以及抗菌肽生物合成的方法、應(yīng)用，指抗菌肽研究和應(yīng)用中的存在問題。 </p><p>　　關(guān)鍵詞： 抗菌肽；人工合成；生物合成；生物活性</p><p>　　Summary：It refers to a fir

5、st antimicrobial peptides insects have been induced to produce the antimicrobial activity of a polypeptide material, a molecular weight of usually about 2000 to 7000, of 20 to 60 amino acid residues. This type of active

6、peptides most highly alkaline, thermal stability and broad-spectrum antimicrobial characteristics, but also because of its including anti-bacteria, fungi, viruses, protozoa, cancer cells and other biological activity, in

7、cluding, and it is difficult to pr</p><p>　　Keywords: antimicrobial peptides; synthetic; biosynthesis; biological activity</p><p>　　第一章 抗菌肽的來源與作用機(jī)制</p><p>　　抗菌肽（antibacterial peptid

8、e， ABP）是一類由生物機(jī)體免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生，用以對(duì)抗外源性病原體的多肽類活性物質(zhì)，廣泛地存在于包括昆蟲、動(dòng)植物以及人體內(nèi)，同時(shí)具有抵御外界微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞能力的一種小分子多肽。目前已經(jīng)有多達(dá)五百多種抗菌肽被分離和鑒定，部分已可以人工合成?？咕目纱笾路殖伤念?殺菌肽類、富含脯氨酸殘基的蛙皮素、富含甘氨酸殘基的蜂毒素、富含肌氨酸殘基的防御素。這些抗菌肽除了具有廣譜抗菌能力外，還有高效專一的抗真菌和抗病毒、抗腫瘤能力。因此，

9、這種抗菌肽類物質(zhì)在現(xiàn)代醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、以及生物技術(shù)上有廣闊的應(yīng)用前景，在此基礎(chǔ)上人工合成抗菌肽則更顯得意義重大。 </p><p>　　1 抗菌肽起源及分類</p><p>　　1.1 抗菌肽的發(fā)現(xiàn) 抗菌肽（antibacterial peptide）是在1974年由瑞典的科學(xué)家Boman等，通過向眉紋天蠶蛾（Samia cyhthia）蛹注射大腸埃希菌后，在血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類具有抗菌活

10、性的堿性多肽類物質(zhì)，隨后在古比天蠶（Hyalophra cecropia）蛹中同樣發(fā)現(xiàn)了類似的抗菌活性物質(zhì)，這種具有抗菌活性的物質(zhì)于1981年被正式命名為抗菌肽（cecropin）。</p><p>　　1.2 抗菌肽的來源 </p><p>　　1.2.1 昆蟲抗菌肽 </p><p>　　昆蟲抗菌肽是最先從美洲天蠶的蛹中分離到的抗菌多肽，命名為天蠶素或者殺菌肽

11、。此后，人們相繼從家蠶、柞蠶、果蠅、麻蠅中也分離到了此類多肽抗生素。殺菌肽類對(duì)革蘭氏陽性菌以及陰性菌都具有很強(qiáng)的殺傷力，但對(duì)真菌和真核細(xì)胞并沒有毒性。目前，殺菌肽類已能被人工合成并已商品化。 </p><p>　　1.2.2 蛙類抗菌肽 </p><p>　　蛙皮膚上有許多腺體，能產(chǎn)生很多種類的生物活性肽。蛙皮素首先在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)，含有21-27個(gè)氨基酸的一種堿性無半肌氨酸的抗菌肽。

12、微摩爾濃度的Magainins就能殺死革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物，甚至真核生物的腫瘤細(xì)胞，但卻不傷害體細(xì)胞或紅細(xì)胞。Magainin家族肽由于其氨基酸的數(shù)目少，具有抗菌活性，當(dāng)人類感染細(xì)菌、真菌或原蟲之后，可能具有治療疾病的潛力。目前應(yīng)用基因工程的方法合成Magainin已經(jīng)進(jìn)入臨床三期試驗(yàn)階段。 </p><p>　　1.2.3 魚類抗菌肽 </p><p>　　魚類抗菌

13、肽是魚機(jī)體天然免疫的重要部分，是一種小分子蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)與組成復(fù)雜多樣。魚類抗菌肽的合成多數(shù)以前肽原形式，通過酶解方式切除信號(hào)肽以及羧基端酸性片段后，形成具有活性的成熟肽。成熟肽有很強(qiáng)的抑菌活性，其最小的抑制濃度大多在毫摩爾水平。迄今，幾十種魚類抗菌肽已被分離出來，并且多個(gè)抗菌肽基因已經(jīng)能被克隆。 </p><p>　　1.2.4 哺乳動(dòng)物抗菌肽 </p><p>　　在哺乳動(dòng)物中，抗

14、菌肽由吞噬細(xì)胞和黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)。Lee（1989）最先從豬小腸分離出殺菌肽P1，Agerberth （1991）從豬小腸分離出抗菌肽PR-39。Andersson（1995）又從豬小腸純化得到抗菌肽NIA-lysin。Heller（1998）從豬白細(xì)胞中分離得到抗菌肽Protegrins（PGs）。Schonwetter（1995）從牛中性粒細(xì)胞分離得到抗菌肽Bactencin。Shamova（1999）從綿羊、山羊白細(xì)胞分離得到的抗

15、菌肽OaBac5和CHBac5與牛Bac5同源，富含有脯氨酸，具有廣譜抗菌的特點(diǎn)。 </p><p>　　1.3 抗菌肽的分類</p><p>　　根據(jù)迄今對(duì)抗菌肽的研究可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)抗菌肽的分類方式除來源不同外，還有根據(jù)其結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)來進(jìn)行分類，常見還有以下幾種分類方式。一種是將抗菌肽分成五類:殺菌肽（cecropins）、爪蟾抗菌肽（magainins），防御素（defensins），宣

16、肽素（tachyplesins）以及內(nèi)源型抗菌肽（cathelicidin）。另一種則是根據(jù)抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象組成特征，進(jìn)而將抗菌肽分成四型:α-螺旋抗菌肽，具有二硫鍵的β折疊抗菌肽，富含脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly）的抗菌肽，和具有板狀結(jié)構(gòu)的抗菌肽。此外還有根據(jù)其所帶電荷進(jìn)行相應(yīng)的分類，為:普通陰離子型，普通陽離子型，特殊氨基酸的陽離子型，二硫橋型，片段型。 </p><p>　　抗菌肽的理化性質(zhì)和作

17、用機(jī)制 </p><p>　　2.1 抗菌肽的理化性質(zhì)</p><p>　　雖然抗菌肽的結(jié)構(gòu)各異，但幾乎所有的抗菌肽在其本質(zhì)上都具有一些共性，其理化性質(zhì)現(xiàn)在已基本清楚，它們通常是由1250個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量通常在4KD左右，它們是生物先天免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的重要組成部分[1]。大多數(shù)抗菌肽的水溶性很好、等電點(diǎn)大于7，有較強(qiáng)的陽離子特征，并具有兩親α-螺旋或兩親β-折疊結(jié)構(gòu)。據(jù)郭玉梅等報(bào)

18、道，家蠶抗菌肽在高溫高壓下處理30 min仍能保持其原有活性，足以說明抗菌肽具有熱穩(wěn)定性?？咕脑谳^大的離子強(qiáng)度及較低或較高的pH值下仍能保持較強(qiáng)的活性[2]。但還有文獻(xiàn)報(bào)道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有陰離子特性的抗菌肽類型，其作用機(jī)制和陽離子抗菌肽也不盡相同[3] 。除此之外，一些抗菌肽還有抵抗胰蛋白酶及胃蛋白酶水解的能力。 </p><p>　　2.2 抗菌肽的作用機(jī)制 </p><p>　　雖然

19、人類至今還沒有完全了解抗菌肽的詳細(xì)作用機(jī)制，但根據(jù)現(xiàn)有的多項(xiàng)相關(guān)研究可以表明，大部分的抗菌肽可以直接作用于微生物細(xì)胞膜。因此科學(xué)界現(xiàn)在主要提出了三種理論模型，其中包括:孔洞學(xué)、可變毯模型和離子通道學(xué)說，而相關(guān)抗菌肽的通路和熱力學(xué)的研究目前還在進(jìn)行。 其中基于抗菌肽對(duì)細(xì)胞膜的作用是被廣泛接受的觀點(diǎn)，這種觀點(diǎn)認(rèn)為大多數(shù)抗菌肽最根本的作用機(jī)制是，由于帶正電荷的多肽，通過靜電作用和帶負(fù)電的磷脂膜結(jié)合，形成螺旋或者折疊結(jié)構(gòu)，從而在細(xì)胞膜上形成了

20、離子通道或裂解細(xì)胞膜，從而破壞了細(xì)胞或細(xì)菌質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大量胞內(nèi)水溶性物質(zhì)滲出，進(jìn)而達(dá)到殺死目標(biāo)微生物的作用。</p><p>　　另一種觀點(diǎn)是基于細(xì)胞內(nèi)機(jī)制[4]，如α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽分子是親水和疏水兩親性的，故在與細(xì)胞膜結(jié)合后，可以通過膜內(nèi)分子間位移，最后使得抗菌肽分子聚集而形成離子性通道，改變細(xì)胞膜勢(shì)，進(jìn)而殺滅微生物。</p><p>　　近期的研究對(duì)抗菌肽作用機(jī)制提出了新的觀點(diǎn)

21、，最新研究發(fā)現(xiàn)，有部分抗菌肽能先通過靜電作用和細(xì)胞膜相互吸引與結(jié)合，其形成的離子通道為瞬時(shí)的，能使得抗菌肽進(jìn)入胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)容物作用，例如抑制核普酸[5]、抑制蛋白質(zhì)[6]、影響線粒體[7]等。另外還有研究指出有部分抗菌肽殺滅細(xì)菌后，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)卻無損壞，以上研究都表明抗菌肽可能對(duì)細(xì)菌的作用存在著胞內(nèi)作用靶點(diǎn)。 </p><p>　　以上幾種觀點(diǎn)都能較好地闡釋抗菌肽對(duì)正常的真核細(xì)胞基本無作用或?yàn)榈妥饔?，因?yàn)檎婧思?xì)

22、胞的膜表面主要為中性或兼性磷脂，故抗菌肽對(duì)其作用較弱。由于抗菌肽自身具有一定安全性，并有有效抑菌的功能，其分子結(jié)構(gòu)特征又是發(fā)揮上述機(jī)制作用的重要基礎(chǔ)，故人工改造與合成抗菌肽便有了重要的意義。 </p><p>　　第二章 抗菌肽的生物合成及生物活性</p><p>　　1 抗菌肽的設(shè)計(jì)及合成 </p><p>　　1.1 抗菌肽的設(shè)計(jì)</p>&

23、lt;p>　　雖然抗菌肽和傳統(tǒng)抗生素相比表現(xiàn)出了許多優(yōu)點(diǎn)，但是很多天然抗菌肽藥物的代謝動(dòng)力學(xué)與藥物毒性還不是很清楚，其生產(chǎn)和制備成本比較高，且部分抗菌肽抗菌譜較窄、抗菌活性較低、穩(wěn)定性差，有些抗菌肽活性和溶血活性都較強(qiáng)，故設(shè)計(jì)或改造抗菌肽來獲得更加安全、有效、穩(wěn)定的抗菌肽則具有現(xiàn)實(shí)意義。目前為止抗菌肽的設(shè)計(jì)主要是利用結(jié)構(gòu)輔助設(shè)計(jì)的方法來對(duì)母肽分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖儊韮?yōu)化抗菌肽的凈電荷、疏水氨基酸殘基比例、兩親性、分子柔性或特定的二級(jí)結(jié)

24、構(gòu)。 </p><p>　　1.1.1 序列修飾法</p><p>　　該方法包含了所有對(duì)天然抗菌肽修飾，包括刪除、添加或者將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基更替、截?cái)嚯牡腘-端或C-端或者將組天然肽的不同肽段嵌合。此方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于Cecropin， Magainin和Melitti的研究 [8，9]。 </p><p>　　1.1.2 最低綱領(lǐng)法</p>

25、<p>　　該方法包含了全部基于兩親α-螺旋抗菌肽結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)。一般限制一或多個(gè)基本氨基酸例如賴氨酸或精氨酸，與此同時(shí)限制一或兩個(gè)疏水性殘基如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。該方法可得到相當(dāng)強(qiáng)效的抗菌劑，但他們忽略了進(jìn)化過程對(duì)肽序列氨基酸的選擇，這樣有可能會(huì)導(dǎo)致失去抗菌肽的選擇性。 </p><p>　　1.1.3 合成組合文庫 </p><p>　　

26、合成組合文庫能快速獲得活性化合物的優(yōu)化分類。用這種方法開發(fā)的α-螺旋抗菌肽存在一個(gè)問題，由于抗菌肽分子較大（超過10個(gè)氨基酸殘基），這使得位置掃描或者迭代的方法不切實(shí)際。 </p><p>　　1.1.4 模板輔助法 </p><p>　　這種方法通過比對(duì)天然抗菌肽的序列并抽象統(tǒng)計(jì)其顯著特性（如電荷、疏水性等等）的從頭設(shè)計(jì)方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是減少了肽合成的數(shù)量

27、但是得到有用的結(jié)果，它與序列修飾方法相比較保存了肽序列的基本信息。 </p><p>　　1.1.5 生物信息分析和軟件輔助法 </p><p>　　生物信息學(xué)包括了數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息技術(shù)和分子生物學(xué)等學(xué)科，它研究的領(lǐng)域主要包括:藥物設(shè)計(jì)、基因進(jìn)化、基因組序列分析、基因區(qū)域、功能預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等。該學(xué)科在海量數(shù)據(jù)的高效分析上發(fā)揮重要作用。&

28、#160;</p><p>　　生物數(shù)據(jù)庫主要涵蓋基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及功能信息學(xué)的龐大信息，具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)組織及處理功能。特別是針對(duì)抗菌肽而構(gòu)建的抗菌肽數(shù)據(jù)庫已經(jīng)成為抗菌肽開發(fā)設(shè)計(jì)及研究不可缺少的輔助工具，其主要分為四大類:（1）天然抗菌肽數(shù)據(jù)庫:AMSDb，APD，DAMPD，YADAMP和AMPer；（2）天然的特定抗菌肽數(shù)據(jù)庫:Peptaibol，PenBase，BACTIBASE，Defensins，

29、DAPD和PhytAMP；（3）非天然來源的抗菌肽數(shù)據(jù)庫:SAPD和RAPD；（4）抗菌肽預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫:BAGEL，AntiBP和CAMP。生物信息分析及軟件輔助的抗菌肽設(shè)計(jì)方法主要對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)及活性進(jìn)行分析、預(yù)測(cè)，在較低的花費(fèi)和較短的時(shí)間成本下獲得相對(duì)可靠的信息。</p><p>　　1.2 抗菌肽合成的基本方法 </p><p>　　1.2.1 液相合成 </p>

30、;<p>　　抗菌肽最早的合成是使用液相合成的辦法，即把需要合成的氨基酸或者短肽配制成液體溶液，其中之一的氨基端和另外的羧基端及不發(fā)生反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)被有效的化學(xué)基團(tuán)保護(hù)，而需要反應(yīng)的氨基端和竣基端則分別活化，在液體中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，二者偶連在一起。反應(yīng)完畢后，需要用各種方法把沒有參加反應(yīng)的原料試劑和活化試劑分離出去，以便純化合成產(chǎn)物。其使用的方法有萃取，重結(jié)晶，薄板層析等等。已純化好的合成產(chǎn)物要根據(jù)需要而決定是否保留側(cè)鏈的保

31、護(hù)基團(tuán)。重復(fù)執(zhí)行這樣的步驟，直到需要的肽段合成完畢為止。該方法的好處是，其使用的化學(xué)原料比較便宜；反應(yīng)體系可以保持較大的濃度，能夠提高反應(yīng)效率；其使用的純化手段簡單，不需要特別昂貴的儀器等等。但是所帶來的缺點(diǎn)是:由于不同肽段的化學(xué)性質(zhì)不同，所以該采用什么純化中間產(chǎn)品的方法不容易確定，甚至有些肽段很難用萃取，重結(jié)晶的辦法純化。需要針對(duì)不同的肽段采用不同的保護(hù)方式；在反應(yīng)完畢后，將這些保護(hù)基團(tuán)切割下來的方法也不同，需要采用驗(yàn)證試驗(yàn)的辦法選擇

32、，如果是長肽段將有可能十分繁瑣，甚至找不到一個(gè)合適的解決辦法。因此，采用液相合成辦法合成抗菌肽的方法己經(jīng)越來越集中到合成較短的肽段上面，如3-4肽，</p><p>　　1.2.2 固相合成 </p><p>　　抗菌肽的固相合成方法是1963年由R.Bmerrifleld首創(chuàng)的，R.B.merrifield首先提出了將氨基酸的羧基末端和一類固體樹脂載體上的化學(xué)基團(tuán)連接，暴露出的

33、氨基端用于接肽反應(yīng)，下一步需要連接的氨基酸則利用不同的方法保護(hù)其氨基端及側(cè)鏈基團(tuán)，僅允許它的羧基端暴露并活化，和連在樹脂上的氨基端進(jìn)行連接反應(yīng)。由于此方法不只用于抗菌肽合成，同時(shí)對(duì)化學(xué)有機(jī)合成也有深遠(yuǎn)的影響，R.B.merrifield先生憑此于1984年憑此獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是，充當(dāng)固體載體的樹脂同時(shí)可以充當(dāng)氨基酸羧基末端的保護(hù)基團(tuán)；化學(xué)反應(yīng)則是在固體載體的外掛基團(tuán)上進(jìn)行的，但基團(tuán)始終連接在固體上面，因此每一步中間產(chǎn)

34、品的純化僅使用有機(jī)溶劑洗滌固體載體即可，反應(yīng)的氨基酸則連接到載體上面而始終保留，沒有反應(yīng)的化學(xué)試劑則是通過洗滌被排除到反應(yīng)體系外，而不污染反應(yīng)體系。每一步的氨基酸連接反應(yīng)僅是簡單地將連接在樹脂上面的肽段的氨基末端的保護(hù)基團(tuán)通過化學(xué)方法切割，同時(shí)將待連接的保護(hù)氨基酸的羧基末端活化，然后就能夠連接到肽段的氨基末端。固相合成抗菌肽原則上來說可以從抗菌肽的任意段開始合成，甚至能從抗菌肽的中間向兩邊</p><p>　　在

35、固相合成擁有很多有利條件的同時(shí)，此方法也有其不足之處，例如:其采用的固相載體的樹脂上所連接的化學(xué)基團(tuán)不能夠過多，否則會(huì)由于空間位阻的原因，使得這些基團(tuán)不可能參加反應(yīng)，這樣，參加反應(yīng)的體系濃度不會(huì)過大，導(dǎo)致連接效率下降，為了消除這種不利，采取加大反應(yīng)試劑的消耗的辦法來彌補(bǔ)，增加了合成成本。但由于其每一步的中間產(chǎn)品不經(jīng)過純化，盡管反應(yīng)效率高達(dá)99%，多步積累后仍會(huì)有相當(dāng)多的沒有完全反應(yīng)的產(chǎn)物留在樹枝上，最后導(dǎo)致不能繼續(xù)連接氨基酸。因此采用固

36、相法合成法一般是連接長度在40個(gè)左右氨基酸的抗菌肽，再長的抗菌肽會(huì)很難完成。除此之外，由于所有抗菌肽的產(chǎn)物純化是在最后一起完成的，所以為了高效的分離這些雜質(zhì)，必須采用昂貴的HPLC設(shè)備來進(jìn)行純化。這都是使用固相合成方法的一些不足。所以為了彌補(bǔ)這些不足，化學(xué)家后來又開發(fā)了片斷相連法來連接更長的抗菌肽。 </p><p>　　1.2.3片斷法合成</p><p>　　液相片斷合成的基礎(chǔ)其實(shí)還

37、是固相合成，其基本原理是利用固相合成法先合成所需要合成的抗菌肽段的所有片斷，例如十個(gè)氨基酸殘基的肽段；而后分別純化鑒定，最終再把這些抗菌肽片斷在溶液中或者樹脂上按照順序全部連接起來。依此方法能夠合成利用傳統(tǒng)固相合成方法不能夠合成出來的比較長的抗菌肽[10]。一般來說較短的肽段比較好合成，純化也較容易，所以片斷的合成比長肽要容易制備；隨后以片斷為單位連接成長肽，如果在合成中片段沒有連上，則連接的片</p><p>

38、　　斷和最終產(chǎn)物理化性質(zhì)也有較大的不同，所以比較容易分離，這使得分離純化更好的進(jìn)行。利用這個(gè)方式，可以合成的抗菌肽長度能達(dá)到100個(gè)左右的殘基。這是它的長處，而短處就是要消耗更多的試劑；同時(shí)，每個(gè)片斷都要純化，比較消耗時(shí)間。但相比較對(duì)于用一般的辦法不能夠合成出來的抗菌肽來講，采取這種辦法有時(shí)是唯一的選擇。</p><p>　　1.2.4基因工程合成</p><p>　　首先是利用差異顯示技

39、術(shù)對(duì)進(jìn)行誘導(dǎo)和未進(jìn)行誘導(dǎo)基因的差異表達(dá)進(jìn)行研究，可得到一些新的抗菌肽類相關(guān)基因，這是關(guān)于基因分離、表達(dá)研究的較新的方法。Kim等就利用差異顯示技術(shù)分離到了一種新抗菌肽Enbocin。他們用大腸桿菌感染加餐幼蟲，構(gòu)建cD-NA文庫，后以α-32pATP標(biāo)記，選出感染的與未感染的家蠶差異DNA克隆，在基因文庫頂用λDASH試劑選出陽性克隆，酶切、測(cè)序，得到Enbocin基因序列。據(jù)此設(shè)計(jì)引物從昆蟲細(xì)胞rnRNA 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，再將此

40、擴(kuò)增片段導(dǎo)入克隆載體與表達(dá)載體，最后用Northern biot、尿素-SDS-PAGE可證明并檢測(cè)到Enbocin的表達(dá)，在海內(nèi)，劉振義、屈賢銘也利用該方法成功得到了長度為241bp的片斷，該片斷可能在昆蟲免疫反應(yīng)中扮演重要角色。其次是采用融合表達(dá)的方法，該方法是將抗菌肽基因與另外一種基因連接起來，共同構(gòu)建成融合基因，并克隆到表達(dá)載體上，最后在經(jīng)誘導(dǎo)、切割而得到抗菌肽基因表達(dá)的蛋白。 </p><p><

41、b>　　3 生物活性及特點(diǎn)</b></p><p><b>　　2.1 抗細(xì)菌活性</b></p><p>　　關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)理，不同的學(xué)者提出了不同的看法[10]。目前研究得最為清楚的是膜滲透機(jī)理，認(rèn)為抗菌肽是利用自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成電勢(shì)依賴性通道，改變細(xì)胞膜的通透性，造成細(xì)胞內(nèi)容物外泄而死亡。具體過程是抗菌膚分子通過其兩親性α-

42、螺旋上的正電荷與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷之間的靜電吸引而結(jié)合在質(zhì)膜上，緊接著抗菌膚分子中的疏水端插入到質(zhì)膜中，之后α-螺旋也插入到質(zhì)膜中，這樣就打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序，使細(xì)菌失去了膜勢(shì)，不能保持正常的滲透壓而死亡[11]。</p><p>　　圖1 抗菌肽的作用機(jī)理</p><p>　　多數(shù)抗菌肽對(duì)革蘭陽性菌，革蘭陰性菌及真菌有較廣的抗菌活性，尤其對(duì)耐藥菌株有明顯的殺

43、滅作用，且不破壞生物體細(xì)胞，無免疫原性[12]。Eduard等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與靜電聚肽相比， 兩親性抗菌肽能夠更迅速地攻擊細(xì)胞膜的水脂界面， 從而導(dǎo)致細(xì)胞膜失活。Verardi等[14]通過核磁共振光譜技術(shù)對(duì)distinctin的脂質(zhì)電荷和兩親性進(jìn)行分析，研究推斷，高濃度的抗菌肽會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用或形成空洞， 而瓦解細(xì)胞是通過其他的機(jī)制完成的。也有學(xué)者認(rèn)為抗菌肽作用于膜蛋白，蛋白質(zhì)凝集失活，細(xì)胞膜變性，形成離子通道，改變了膜的通

44、透性，從而阻礙生物大分子的合成?？傊?，抗菌肽是使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大而導(dǎo)致細(xì)菌死亡的[15]。對(duì)于不同類別的抗菌肽結(jié)構(gòu)不同其作用機(jī)制可能不同，并且同一種抗菌肽也可能通過多種途徑發(fā)揮作用，因此抗菌肽的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究[16]。</p><p><b>　　2.2 抗病毒活性</b></p><p>　　抗菌肽對(duì)病毒的作用 目前研究證明抗菌肽可以3種不同的機(jī)制

45、起到抗病毒的作用[17]。第1種是通過直接與病毒粒子相結(jié)合而起作用。如防御素等對(duì)皰疹病毒用,Polyphemusins對(duì)人免疫缺陷病毒的作用。第2種是抑制病毒的繁殖，如蜂毒素和殺菌肽對(duì)人免疫缺陷病毒的作用。第3種是通過模仿病毒的侵染過程而起作用，如蜂毒素及其類似物K71的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒衣殼蛋白的部分氨基酸序列存在相似性，而這部分序列在病毒顆粒組裝中與RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合密切相關(guān)，這樣蜂毒蛋白分子可以偽裝成病毒包被蛋白，參與病毒合成被病

46、毒RNA結(jié)合，導(dǎo)致RNA的構(gòu)象改變，不能與正常蛋白質(zhì)結(jié)合，病毒顆粒無法正常組裝[18]。</p><p>　　Dean等[19]通過密度梯度試驗(yàn)分析抗菌肽LL37對(duì)牛痘病毒的治療作用，結(jié)果表明，抗菌肽可以有效地移除病毒細(xì)胞膜外膜而使細(xì)胞膜失</p><p>　　活，這種失活作用機(jī)制與介導(dǎo)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞的地毯模型一致。研究發(fā)現(xiàn)，許多a防御素對(duì)單疙疹病毒、流感病毒和艾滋病病毒等被膜病毒有明顯的

47、殺傷力。Melitiin和Cecropins在亞毒性濃度下通過阻礙基因表達(dá)來抑制HIV-1病毒的增殖[20]。這些肽對(duì)病毒被膜直接起作用，而不是抑制病毒DNA的復(fù)制或基因表達(dá)。</p><p><b>　　2.3 抗真菌活性</b></p><p>　　許多常見抗菌肽如 cecropin、defensin 家族等都具有抗真菌的活性。而其抗真菌活性一般比抗細(xì)菌活性要低，

48、這主要是由于細(xì)胞膜的組成成分不同造成的[21]。當(dāng)抗菌肽 HP(2-20)上第16位和第18位的色氨酸(Trp)分別被谷氨酰胺(Gln)和天冬氨酸(Asp)替換后，其疏水性得到了增加，其抗細(xì)菌與抗真菌的活性也有了明顯的提高作用[22]。</p><p>　　Arenas等[23]對(duì)智利扇貝血細(xì)胞中分離和純化出天然的抗菌肽。從初級(jí)結(jié)構(gòu)分析，這個(gè)抗菌肽有47個(gè)氨基酸殘基，其中25%為疏水氨基酸，并帶有凈電荷基于這些設(shè)

49、計(jì)合成了一個(gè)由30個(gè)氨基酸組成、含38%疏水分子、凈電荷為+5的抗菌肽；這個(gè)抗菌肽比先前天然的抗菌肽更具有活性，對(duì)魚CHSE－214沒有毒性。經(jīng)過化學(xué)修飾的天然抗菌肽有可能成為傳統(tǒng)抗生素的替代物，對(duì)于魚在不同時(shí)期生長時(shí)控制寄生病理真菌具有非常重要的作用。Rahnamaeian等[24]報(bào) 道 一 種 由基酸殘基組成、富含脯氨酸的抗菌肽在黑腹果蠅的脂肪中分離出來，這種抗菌肽對(duì)危害大麥的真菌（如禾谷鐮刀菌）具有抵抗作用。從昆蟲中分離出來的某

50、些抗真菌抗菌肽對(duì)于抵抗某些特異性的植物疾病和提高谷類植物的產(chǎn)量是非常有價(jià)值的。死亡素（thanatin）是一種抗菌肽，具有廣譜抗菌范圍。Imamura等[25]將合成的死亡素基因轉(zhuǎn)入到大米中，幾株轉(zhuǎn)化株表現(xiàn)出積極的抗真菌活性，對(duì)稻瘟病菌抵抗效果顯著。</p><p><b>　　2.4 抗癌活性</b></p><p>　　抗菌肽對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞無不良影響

51、，但對(duì)癌細(xì)胞株則有明顯殺傷作用。某些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，細(xì)胞質(zhì)膜易被天蠶素抗菌膚插入而形成離子通道，最終將腫瘤細(xì)胞破壞而達(dá)到治療腫瘤的目的。天蠶素、爪蛙素、鼠天蠶素抗菌肽NP-1和NP-2及天蠶素抗菌肽HNP-1均表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞如纖維瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等的殺傷作用。J.S.Yc等[26-28]研究發(fā)現(xiàn)白血病腫瘤細(xì)胞在抗菌肽作用下產(chǎn)生一系列的病理變化,造成細(xì)胞器高度腫脹，膜與胞質(zhì)分離，細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)排列紊亂，線粒體腫

52、脹、膨大、呈空胞化變性、膜局部結(jié)構(gòu)破裂缺損，崩解成碎片。Niv Papo等[29]設(shè)計(jì)出含15個(gè)氨基酸的肽，目標(biāo)是雄激素依賴和非雄激素依賴人類前列腺癌細(xì)胞系(CL1、22RV1和LNCaP)。Wang 等[30]對(duì)抗菌肽 Polybia-MPI 進(jìn)行了研究，該肽對(duì)人白血病細(xì)胞有良好的抑制效果。當(dāng)對(duì)細(xì)胞用該肽進(jìn)行處理時(shí)，受損傷的細(xì)胞會(huì)分泌乳酸脫氫酶（LDH）。其結(jié)果顯示，纖維原細(xì)胞分泌的 LDH 要遠(yuǎn)少于瘤細(xì)胞。這說明，該肽對(duì)正常細(xì)胞與癌

53、細(xì)胞有一定的選擇性。氨基酸替換實(shí)驗(yàn)證實(shí)了α-螺旋的溶血性與高疏水性、高兩親性</p><p><b>　　參考文獻(xiàn) </b></p><p>　　[1] Boman HG, Nisson I, Rasmuson B. Inducible antibacterial de

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