逆轉(zhuǎn)座子atrl誘導(dǎo)元帥系蘋果短枝變異分子機(jī)理的初步研究.pdf

1、 I摘要前期研究表明逆轉(zhuǎn)座子 atr1 參與了蘋果元帥系的短枝變異，為揭示其變異機(jī)理，本研究借助已獲得的 atr1-LTRs 和 IPCR 技術(shù)分離了 atr1 部分序列；利用 IRAP-PCR在元帥系短枝變異品種中分離出一條特異性片段，并以此為切入點(diǎn)，在“元帥”短枝變異品種中獲得了特異片段的部分側(cè)翼序列， 序列比對(duì)結(jié)果表明四個(gè)短枝變異品種中特異性片段相同，本研究為揭示逆轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)蘋果短枝變異機(jī)理提供了基礎(chǔ)。1、逆轉(zhuǎn)座子 atr1-L

2、TRs 部分側(cè)翼序列。根據(jù)前期獲得 atr1-LTRs 的 500bp 片段，利用 IPCR 分離其側(cè)翼序列。借助 atr1-LTRs 設(shè)計(jì)兩對(duì)反向引物，利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)“玫瑰紅”基因組 DNA 進(jìn)行充分酶切后，用 T4 連接酶將酶切片段連接成環(huán)作為 PCR 模板。兩輪巢式 PCR 后，測序得到一條片段大小為 1896bp。將該片段與先前的 atr1-LTRs 片段拼接后設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，在“玫瑰紅”基因組 DNA 中進(jìn)行擴(kuò)增，

3、最終測序得到一條 2124bp 的片段。分析表明其中包含了“逆轉(zhuǎn)錄酶基因（RT）的部分片段、RNaseH 和 3’-LTR 部分及其側(cè)翼序列” 。2、基于 atr1 的蘋果元帥系短枝變異品種特異性片段的分離。以蘋果“元帥”及其短枝變異品種“華帥 1 號(hào)” 、 “矮紅” 、 “奧勒岡矮生”和“玫瑰紅”的基因組 DNA為模板，利用 atr1-LTRs 設(shè)計(jì)引物，根據(jù)優(yōu)化的 IRAP-PCR 體系和程序，擴(kuò)增出“元帥”及其短枝變異品種指紋圖譜

4、，并分離出一條差異條帶。測序結(jié)果中， “華帥 1 號(hào)”得到兩條長度分別是 809bp 和 758bp 的特異片段，命名為 Hs1 和 Hs1’ ， “矮紅” 、 “奧勒岡矮生” 和 “玫瑰紅” 品種分別得到了一條長度為 809bp 的特異片段， 命名為 Ah1、Alg1 和 Mgh1。在此基礎(chǔ)上，每條特異片段設(shè)計(jì)一條較長的引物，分別在“元帥” 及其短枝變異品種進(jìn)行驗(yàn)證，成功將 IRAP 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為 SCAR 標(biāo)記。3、TAIL-PCR

5、分離元帥系短枝變異品種中特異片段的側(cè)翼序列。先根據(jù) Mgh1設(shè)計(jì)三條巢式特異引物，與簡并引物相結(jié)合，優(yōu)化了三輪 PCR 擴(kuò)增體系和程序，得到測序結(jié)果后與 Mgh1 序列拼接并設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物， 在 “元帥” 及其短枝變異品種擴(kuò)增，得到特異片段 Hs2、Ah2、Alg2 和 Mgh2。再根據(jù) Hs2 設(shè)計(jì)三條巢式特異引物，與簡并引物相結(jié)合，經(jīng)過三輪 PCR 擴(kuò)增，得到測序結(jié)果后與 Hs2 序列拼接并設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物， 在 “元帥” 及其短枝變異品