湖羊Lrh-1和LHR基因的研究.pdf

1、肝受體類似物-1(Theliverreceptorhomolog-1;Lrh-1)屬于核受體(Nuclearreceptors;NRs)5A亞家族中第2個(gè)成員(Nuclearreceptorsubfamily5，groupA,member2)，所以Lrh-1也稱NR5A2。Lrh-1自小鼠肝臟中克隆出來以后，已采用原位雜交、逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction;RT-PC

2、R)、Northern雜交和免疫組化方法證明Lrh-1mRNA和蛋白在人和小鼠心、胃、肺、腦、肝、膽囊、胰腺外分泌部、唾液腺、腸、卵巢、脂肪、膀胱等組織中存在，表明Lrh-1在動(dòng)物胚胎發(fā)育、分化、膽固醇代謝、膽汁酸的動(dòng)態(tài)平衡以及類固醇激素生成等方面具有重要的作用。本研究采用cDNA末端快速克隆技術(shù)(rapid-amplificationofcDNAends;RACE)、實(shí)時(shí)熒光定量(Real-timereverse-transcript

3、ionPCR;qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)、免疫組織化學(xué)方法對(duì)湖羊Lrh-1基因進(jìn)行了檢測(cè)與生物信息學(xué)分析，獲得湖羊Lrh-1基因在組織中的表達(dá)分布以及特異性組織表達(dá)譜，為深入了解Lrh-1基因的生理學(xué)功能、開發(fā)生殖調(diào)控方式以及揭示其在湖羊組織中的調(diào)節(jié)作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　黃體生成素(Luteinizinghormone;LH)是由垂體前葉的促性腺激素細(xì)胞分泌的一種糖蛋白類激素，其作用的發(fā)揮必須依賴促

4、黃體素受體(luteinizinghormonereceptor;LHR)，LH與LHR的胞外功能區(qū)結(jié)合后可激活環(huán)腺苷酸系統(tǒng)(Cyclicadenosinemonophosphate;cAMP)，引起類固醇激素的合成和分泌，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)動(dòng)物性腺發(fā)育和受精卵著床等生理過程。近年來相關(guān)研究表明，LHR不僅在動(dòng)物性腺中有高表達(dá)，在許多非性腺組織中也有豐富的表達(dá)，表明該基因在動(dòng)物非性腺組織中具有重要的調(diào)節(jié)作用。此外，LHR基因突變現(xiàn)已在人和動(dòng)物

5、群體中檢測(cè)到，這些突變中已證實(shí)部分與動(dòng)物性早熟、性腺機(jī)能異常以及繁殖力性狀存在一定的關(guān)系。本研究采用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbentassay;ELISA)方法檢測(cè)了發(fā)情周期四個(gè)階段湖羊LHR基因mRNA和蛋白在非性腺組織中的表達(dá)，以期獲得湖羊LHR基因特異性非性腺組織表達(dá)譜以及在組織中的表達(dá)變化規(guī)律。通過單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism;SNP)

6、方法檢測(cè)三個(gè)綿羊品種（湖羊、晉中綿羊、陵川半細(xì)毛羊）LHR第11外顯子區(qū)多態(tài)性，對(duì)比分析不同突變型與繁殖性狀間相關(guān)性，為綿羊繁殖性狀相關(guān)遺傳標(biāo)記輔助選擇提供參考依據(jù)。
　　本研究共分為四大部分，第一部分采用RACE方法獲得了湖羊Lrh-1基因cDNA序列信息，并分析了該基因的生物信息學(xué)特性;第二部分采用免疫組織化學(xué)、qRT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)湖羊Lrh-1基因mRNA和蛋白在組織中的表達(dá)分布，并分析該基因在發(fā)情

7、周期四個(gè)階段下丘腦和垂體組織中的表達(dá)變化特點(diǎn)。第三部分檢測(cè)并分析了發(fā)情周期四個(gè)階段湖羊LHR基因在組織中的表達(dá);第四部分分析了湖羊LHR基因第11外顯子區(qū)多態(tài)性及與繁殖性狀的相關(guān)性;主要研究結(jié)果如下:
　　第一部分:以湖羊肝臟組織為材料對(duì)Lrh-1基因序列進(jìn)行RT-PCR和RACE測(cè)定，并用DNAman、Tmpred，SignalP3.0，TargetP1.1，Expasy,PSORTⅡprediction等生物信息學(xué)分析軟件和在

8、線工具，對(duì)Lrh-1cDNA序列及其蛋白的理化特性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:湖羊Lrh-1基因cDNA序列全長1488bp，編碼區(qū)共編碼495個(gè)氨基酸，氨基酸序列與牛、人、馬、猴、犬、小鼠、褐鼠的氨基酸同源性分別為98％、97％、96％、97％、97％、86％和86％。
　　第二部分:采用免疫組織化學(xué)和qRT-PCR方法對(duì)湖羊腦、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等組織進(jìn)行-Lrh-1分布定位及組織表達(dá)譜檢測(cè)。結(jié)

9、果顯示，Lrh-1免疫陽性顆粒在湖羊組織中分布廣泛，在檢測(cè)的湖羊下丘腦和垂體分泌細(xì)胞、復(fù)胃和腸道的粘膜上皮細(xì)胞、固有層和腺細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞、輸卵管粘膜分泌細(xì)胞和子宮腺細(xì)胞均有分布，特別是在具有分泌功能的細(xì)胞中有較強(qiáng)的免疫陽性信號(hào)。Lrh-1mRNA在湖羊25個(gè)組織中均檢測(cè)到表達(dá)，其中在下丘腦、回腸、盲腸、胰和子宮組織中檢測(cè)到豐富的表達(dá)量，特別是在下丘腦中表達(dá)量最高。對(duì)比分析發(fā)情周期四個(gè)階段湖羊下丘腦和垂體

10、組織中Lrh-1mRNA表達(dá)量變化規(guī)律，結(jié)果表明，垂體組織中Lrh-1mRNA表達(dá)量在發(fā)情周期四個(gè)階段存在顯著差異(P＜0.05)，在發(fā)情前期時(shí)最高，此后表達(dá)量逐漸減少，至間情期時(shí)達(dá)最低值;下丘腦組織中Lrh-1mRNA表達(dá)量除發(fā)情后期極顯著(P＜0.01)增高外，其他階段表達(dá)量間沒有顯著差異(P＞0.05)。采用Westernblot方法在湖羊下丘腦、垂體、卵巢和輸卵管組織中檢測(cè)到67KD的Lrh-1蛋白。
　　第三部分采用qR

11、T-PCR和ELISA方法對(duì)發(fā)情期（第0天）、發(fā)情后期（第3天）、間情期（第10天）和發(fā)情前期（第14天）的健康、經(jīng)產(chǎn)、同父異母湖羊的下丘腦、垂體、嗅球、延髓、復(fù)胃、大腸、小腸、肝臟、胰腺、腎臟、輸卵管、子宮等21個(gè)非性腺組織樣本中LHRmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)情周期四個(gè)階段湖羊樣本組織中LHRmRNA和蛋白表達(dá)量間存在極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，且具有明顯差異的LHR基因組織表達(dá)譜。在發(fā)情周期不同階段的同一

12、種組織的LHR相對(duì)定量分析中，除個(gè)別組織樣外，多數(shù)組織中的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果均顯示在發(fā)情期時(shí)為最低值。同一種組織中LHR表達(dá)量變化趨勢(shì)分析結(jié)果顯示，垂體、嗅球、輸卵管、子宮、腎臟、空腸、回腸和十二指腸組織中LHR表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，均為在發(fā)情期時(shí)最低，此后表達(dá)量明顯增加，到間情期時(shí)達(dá)最高值，而到發(fā)情前期時(shí)表達(dá)量明顯降低;下丘腦與直腸組織中LHR表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，在發(fā)情后期時(shí)表達(dá)量最高;網(wǎng)胃與結(jié)腸中LHR表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，均在發(fā)情前期時(shí)達(dá)

13、最高值;瓣胃與皺胃組織中LHR表達(dá)量除發(fā)情期最低外，其他階段的表達(dá)量相近，均較豐富。這一結(jié)果表明，LH對(duì)湖羊非性腺組織器官的消化、吸收以及生理代謝等功能可能具有重要的調(diào)節(jié)作用，且在部分組織中的作用強(qiáng)度可能受到發(fā)情周期不同生理狀況的影響。
　　第四部分通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism;PCR-SSCP)檢測(cè)方法

14、，以6對(duì)引物分別檢測(cè)了三個(gè)綿羊品種——湖羊、晉中綿羊和陵川半細(xì)毛羊LHR基因第11外顯子區(qū)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性。在6對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物中，只有引物P2和P6的擴(kuò)增片段具有多態(tài)性。引物P2擴(kuò)增區(qū)存在兩種基因型，分別為LL和LM型，在三個(gè)綿羊品種中均未檢測(cè)到MM型;引物P6擴(kuò)增區(qū)存在6種不同SSCP帶型，經(jīng)序列比對(duì)分析存在T2053A、A2044T和G2003A的錯(cuò)義突變。P2擴(kuò)增區(qū)基因型分布在湖羊和晉中綿羊群體中差異不顯著(P＞0.05)

15、，但分別與陵川半細(xì)毛羊群體存在極顯著差異(P＜0.01);P6擴(kuò)增區(qū),2053、2044、2003位點(diǎn)各基因型分布在湖羊和晉中綿羊間差異不顯著(P＞0.05），而分別與陵川半細(xì)毛羊間存在顯著差異(P＜0.05)。P2擴(kuò)增位點(diǎn)僅陵川半細(xì)毛羊的基因分布不符合哈代—溫伯格定律;P6擴(kuò)增區(qū)湖羊和晉中綿羊在各突變位點(diǎn)的等位基因頻率處于群體平衡狀態(tài)，陵川半細(xì)毛羊除2003突變位點(diǎn)基因分布處于群體不平衡狀態(tài)外，其余突變位點(diǎn)的等位基因頻率分布符合哈代—

16、溫伯格定律;LHR第11外顯子不同基因型湖羊各胎次產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，表明LHR第11外顯子區(qū)多態(tài)性對(duì)湖羊的性早熟和高繁殖力性狀沒有顯著影響。
　　本研究首次系統(tǒng)的對(duì)三個(gè)綿羊品種LHR第11外顯子區(qū)多態(tài)性與繁殖性狀間相關(guān)性、湖羊非性腺組織中LHR在發(fā)情周期四個(gè)階段中的表達(dá)變化以及Lrh-1基因在組織中的分布表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)與分析，這將為綿羊高繁殖力性狀分子標(biāo)記輔助選擇以及深入研究LHR和Lrh-1基因在湖羊組織器官功能