PCOS動物模型及PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究.pdf

1、研究目的和意義： 多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome，PCOS)是育齡期婦女的一種常見內(nèi)分泌紊亂性疾病。PCOS典型的病理生理改變主要包括LH水平升高、高胰島素血癥和高雄激素血癥，因此本研究擬以促黃體生成激素受體(luteinizationhormonereceptor，LHR)、胰島素受體(insulinreceptor，INSR)和雄激素受體(androgenreceptor，AR)為研究對像

2、，采用動物模型和病例對照的研究形式探討三種受體基因是否存在異常的DNA甲基化，期望能夠打破PCOS遺傳學(xué)研究的瓶頸，在PCOS發(fā)病機制的研究中有所突破。 第一部分：DHEA誘導(dǎo)SD大鼠PCoS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究 PCOS起病多在青春期月經(jīng)初潮前后，其病理生理改變與腎上腺功能初現(xiàn)的生理變化驚人相似。 研究方法： 選取23日齡SD雌性大鼠，建模組每日皮下注射DHEA6mg/100g體重

3、，對照組每日皮下注射等體積油劑。注射20天后觀察兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)(HE染色)、性激素(E2、T、P、FSH、LH)及空腹血糖和胰島素的變化，并計算HOMA指數(shù)以評價胰島素抵抗?fàn)顩r。建模成功后利用甲基化特異性PCR技術(shù)，檢測建模組和對照組大鼠LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 1.建模組和對照組一般情況的比較建模組大鼠的體重顯著低于對照組(P=0.000)；去除體重的影響后，建模組大鼠卵巢的重量略大于

4、對照組，但無顯著性差異(P=0.317)。 2.建模組卵巢形態(tài)學(xué)改變建模組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡多呈囊性擴張，各級發(fā)育期卵泡及黃體少見，顆粒細胞層數(shù)減少，卵泡膜細胞、間質(zhì)細胞增生。 3.建模組和對照組血清激素水平及胰島素抵抗的評估建模組大鼠血清E2、T、FSH、FINS、FBG均顯著高于對照組(P均<0.05)；LH水平較對照組有所升高，但無顯著性差異；LH/FSH比值兩組間無顯著性差異，HOMA指數(shù)顯著高于對照組(P=0.

5、000)。 4.建模組和對照組卵巢LHR、INSR和AR基因的甲基化檢測建模組和對照組大鼠卵巢提取的LHR和AR基因經(jīng)甲基化特異性PCR后均未檢出甲基化條帶。INSR基因經(jīng)MSP后檢出甲基化條帶，甲基化率為73.3％，顯著高于對照組(16.7％)(P=0.000)。 小結(jié)： 1.利用DHEA成功誘導(dǎo)SD幼年雌性大鼠出現(xiàn)與PCOS患者相似的卵巢病理改變及雄激素升高和胰島素抵抗等典型內(nèi)分泌變化，建立了一種較為理想的P

6、COS動物模型。 2.利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠LHR、AR基因的甲基化狀態(tài)與對照組相似，INSR基因的甲基化率顯著高于對照組，說明AR、LHR基因并沒有發(fā)生DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，INSR基因則發(fā)生了DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，提示胰島素抵抗、高胰島素血癥可能是腎腺源性雄激素誘發(fā)PCOS的重要原因。 3.此模型大鼠胰島素水平和HOMA指數(shù)顯著高于對照組，同時利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組

7、大鼠INSR基因的甲基化率顯著高于對照組，提示DNA甲基化介導(dǎo)的胰島素受體基因轉(zhuǎn)錄抑制是導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機制之一。 第二部分：避孕硅膠棒聯(lián)合hCG誘導(dǎo)SD大鼠PCOS模型LHR、INSR、AR基因甲基化的研究 LH與高雄激素血癥、胰島素抵抗等PCOS典型病理生理變化均密切相關(guān)，是PCOS起病的中間環(huán)節(jié)。 研究方法： 選取24日齡SD雌性大鼠，建模組皮下埋植左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒3mm/只，

8、3天后(27日齡)開始皮下注射hCG1.5IU2/日。對照組27日齡始每日皮下注射等體積生理鹽水。注射9天后觀察兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)(HE染色)、性激素(E2、T、P、FSH、LH)及空腹血糖和胰島素的變化，并計算HOMA指數(shù)以評價胰島素抵抗?fàn)顩r。建模成功后利用甲基化特異性PCR技術(shù)，檢測建模組和對照組大鼠LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 1.建模組和對照組一般情況的比較建模組大鼠卵巢重量(P=0.0

9、00)和體積(P=0.000)均顯著高于對照組。 2.建模組卵巢形態(tài)學(xué)改變建模組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)卵泡多呈囊性擴張，各級發(fā)育期卵泡及黃體少見，顆粒細胞層數(shù)減少，卵泡膜細胞、間質(zhì)細胞增生。 3.建模組和對照組血清激素水平及胰島素抵抗的評估建模組大鼠血清P、T、LH、FINS、FBG水平均顯著高于對照組(P均<0.05)；LH/FSH比值(P=0.000)和HOMA指數(shù)(P=0.000)也均顯著高于對照組。 4.建模組和

10、對照組卵巢LHR、INSR和AR基因的甲基化檢測建模組和對照組大鼠卵巢提取的LHR和AR基因經(jīng)MSP后均未檢出甲基化條帶；建模組INSR基因經(jīng)MSP后檢出甲基化條帶，建模組的甲基化率為76.7％，顯著高于對照組(20.0％)(P=0.000)。 小結(jié)： 1.利用避孕硅膠棒聯(lián)合hCG成功誘導(dǎo)SD幼年雌性大鼠出現(xiàn)與PCOS患者相似的卵巢病理改變及LH升高、雄激素升高和胰島素抵抗等典型內(nèi)分泌變化，建立了一種較為理想的PCOS動

11、物模型。 2.利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠LHR、AR基因的甲基化狀態(tài)與對照組相似，INSR基因的甲基化率顯著高于對照組，說明AR、IMR基因并沒有發(fā)生DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，INSR基因則發(fā)生了DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，提示胰島素抵抗、高胰島素血癥可能是LH誘發(fā)PCOS的重要原因。 3.此模型大鼠胰島素水平和HOMA指數(shù)顯著高于對照組，同時利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠INSR基因的

12、甲基化率顯著高于對照組，提示DNA甲基化介導(dǎo)的胰島素受體基因轉(zhuǎn)錄抑制是導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機制之一。 第三部分：PCOS患者LHR、INSR、AR基因甲基化的研究 1935年Stein和Leventhal首次真正意義上提出PCOS的診斷和治療方法時，多囊卵巢(polycysticovary，PCO)就是Stein-Leventhal綜合征(S-L綜合癥)最為重要的臨床表現(xiàn)之一。 研究方法： 研究對

13、像均為盆腔輸卵管因素的繼發(fā)不孕患者，年齡25～34歲，BMI18.5～22.9，排除子宮內(nèi)膜異位癥，基礎(chǔ)性激素水平、空腹血糖和空腹胰島素水平均正常，均為長周期降調(diào)節(jié)超促排卵方案且為首個IVF-ET治療周期。PCOS的診斷依照2003年的鹿特丹標(biāo)準，但入選的患者均為稀發(fā)排卵或無排卵同時具有多囊卵巢的患者，并無高雄激素的臨床表現(xiàn)和/或高雄激素血癥。 結(jié)果： 1.PCOS組和對照組一般情況的比較最后參與本項研究的共有69例不孕

14、患者，其中PCOS組39例，對照組30例。兩組患者的年齡、BMI、月經(jīng)第3天基礎(chǔ)激素值(E2、T、P、FSH、LH)、空腹血糖和空腹胰島素均無顯著性差異，LH/FSH比值和HOMA指數(shù)亦無顯著性差異。 2.LHR、INSR和AR基因的甲基化檢測PCOS組和對照組卵巢黃素化顆粒細胞提取的LHR、.AR和INSR基因經(jīng)甲基化特異性PCR后，均未檢出完全化甲基化狀態(tài)的特征條帶，僅部分標(biāo)本檢測出半甲基化狀態(tài)的特征條帶。比較了PCOS組和

15、對照組三條基因的半甲基化狀態(tài)發(fā)生率，未見統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。 小結(jié)： 本部分研究利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)非雄激素增高的PCOS患者和對照組患者LHR、INSR和AR基因的甲基化狀態(tài)無顯著差異，提示PCOS患者出現(xiàn)卵巢PCO的改變目前還不能證實是通過LHR、AR和INSR基因的甲基化模式改變導(dǎo)致的，PCOS患者卵巢PCO改變的發(fā)生機制需要進一步研究。 全文小結(jié)： 1.本研究模擬腎上腺源性

16、雄激素增高和LH水平增高均誘導(dǎo)SD幼年雌性大鼠出現(xiàn)了與PCOS患者相似的卵巢病理改變和內(nèi)分泌代謝變化，成功建立了兩種PCOS動物模型。 2.利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠LHR、AR基因的甲基化狀態(tài)與對照組相似，INSR基因的甲基化率則顯著高于對照組，說明AR、LHR基因并沒有發(fā)生DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，INSR基因則發(fā)生了DNA甲基化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，提示胰島素抵抗、高胰島素血癥可能是腎上腺源性雄激素和LH誘發(fā)

17、PCOS的重要原因。 3.兩種PCOS模型大鼠的胰島素水平和HOMA指數(shù)均顯著高于對照組，同時利用甲基化特異性PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)建模組大鼠INSR基因的甲基化率顯著高于對照組，提示DNA甲基化介導(dǎo)的胰島素受體基因轉(zhuǎn)錄抑制是導(dǎo)致PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機制之一。既往研究認為，胰島素受體后的信號傳導(dǎo)障礙是PCOS胰島素抵抗的發(fā)生機制，本研究結(jié)果卻提示，胰島素受體本身的功能可能因胰島素受體基因的甲基化而受到影響，這對PCOS胰島素抵抗