紅樹甜菜堿-脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Bet-ProT2轉(zhuǎn)化水稻及耐鹽性的初步研究.pdf

1、紅樹林(Mangroves)是生長于熱帶、亞熱帶陸海交匯鹽生木本植物群落，是公認(rèn)的耐鹽、耐海水浸泡能力強(qiáng)的高等植物，近年作為耐鹽研究的常用材料。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸之一，具有很強(qiáng)的水合能力，其疏水端可與蛋白質(zhì)結(jié)合，親水端可與水分子結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)束縛更多的水，防止?jié)B透脅迫條件下細(xì)胞脫水變性。甜菜堿是另一類常見的無毒滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，一方面通過與蛋白質(zhì)的相互作用，保護(hù)生物大分子在高電解質(zhì)濃度下不變性;一方面作為滲透平衡物質(zhì)維持細(xì)胞的膨

2、壓。水稻是世界上最大的糧食作物之一，在中國水稻是種植面積最大的糧食作物，作為中國65％以上人口的主食來源。但由于土地的大面積鹽漬化，造成了水稻大量減產(chǎn)。
　　 本研究以紅樹植物白骨壤為材料，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Bet/Pro T2)，利用生物信息學(xué)方法對Bet/Pro T2基因的cDNA序列和Bet/ProT2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，同時(shí)采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將攜帶有g(shù)fp報(bào)告基因的35S-B

3、et/ProT2-GFP融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，根據(jù)GFP蛋白在激發(fā)光下發(fā)出的綠色熒光來確定Bet/ProT2蛋白的亞細(xì)胞定位。并且進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bet/ProT2轉(zhuǎn)入粳稻日本晴愈傷組織中，經(jīng)過抗性篩選，煉苗，大田繁殖得到T2代再生苗。最后通過DNA及RNA水平的PCR鑒定再生苗并經(jīng)H2O2的組織化學(xué)測定及150mmol/L NaCl的鹽脅迫檢測轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽能力。本研究旨在通過基因工程的手段提高水稻的耐鹽性，為研究Bet

4、/ProT2基因的耐鹽機(jī)理奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明:
　　 在NCBI上查到Bet/ProT2基因（登錄號AB075903）CDS區(qū)長1344bp。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Bet/ProT2基因CDS區(qū)長1344bp。Bet/ProT2蛋白含有447個(gè)氨基酸殘基，相對分子量為48647.9KDa,理論等電點(diǎn)PI=9.4，帶正電荷，為疏水性蛋白質(zhì)。通過氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，Bet/ProT2蛋白氨基酸序列與其擬南芥中3個(gè)脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子

5、AtProT1、AtProT2、AtProT3同源性分別為73％、71％、71％;與馬鈴薯2個(gè)脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子LeProT1、LeProT2的同源性分別為65％、67％;與甜菜中甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子BvBet/ProT同源性為71％。從而可推測Bet/ProT2蛋白與甜菜堿/脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)具有一定的關(guān)系。該蛋白有11個(gè)跨膜區(qū);同時(shí)亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在葉綠體，線粒體，含有信號肽以及在其他位置的可能性分別為:0.054，0.121，0.

6、032，0.949。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察，只含35S-GFP的表達(dá)載體的洋蔥表皮細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)都有綠色熒光;而含有35S-Bet/ProT2-GFP融合表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染的洋蔥表皮細(xì)胞只有細(xì)胞質(zhì)膜上有綠色熒光的分布。通過試驗(yàn)的手段說明了Bet/ProT2蛋白為定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜蛋白。結(jié)合生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位試驗(yàn)說明，Bet/ProT2蛋白為一個(gè)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上的甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　 PCR鑒定結(jié)

7、果表明Bet/ProT2基因已經(jīng)整合到5個(gè)T2代株系的日本晴粳稻的基因組中且得到了表達(dá)。對轉(zhuǎn)Bet/Pro T2基因水稻T2代的分析表明，Bet/Pro T2基因?qū)λ驹谡l件下的生長沒有顯著影響，但由于Bet/Pro T2基因的過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株可以有效利用外界存在的甜菜堿和脯氨酸促進(jìn)植株生長，表現(xiàn)出比野生型更好的長勢。在不存在甜菜堿/脯氨酸的條件下，轉(zhuǎn)基因植株并沒有表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽能力，而在甜菜堿和脯氨酸單獨(dú)或同時(shí)存在時(shí)，和野生型