紅樹甜菜堿-脯氨酸轉運蛋白基因Bet-ProT2轉化水稻及耐鹽性的初步研究.pdf

1、紅樹林(Mangroves)是生長于熱帶、亞熱帶陸海交匯鹽生木本植物群落，是公認的耐鹽、耐海水浸泡能力強的高等植物，近年作為耐鹽研究的常用材料。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸之一，具有很強的水合能力，其疏水端可與蛋白質結合，親水端可與水分子結合，從而使蛋白質束縛更多的水，防止?jié)B透脅迫條件下細胞脫水變性。甜菜堿是另一類常見的無毒滲透調節(jié)物質，一方面通過與蛋白質的相互作用，保護生物大分子在高電解質濃度下不變性;一方面作為滲透平衡物質維持細胞的膨

2、壓。水稻是世界上最大的糧食作物之一，在中國水稻是種植面積最大的糧食作物，作為中國65％以上人口的主食來源。但由于土地的大面積鹽漬化，造成了水稻大量減產。
　　 本研究以紅樹植物白骨壤為材料，通過RT-PCR的方法擴增甜菜堿/脯氨酸轉運蛋白基因(Bet/Pro T2)，利用生物信息學方法對Bet/Pro T2基因的cDNA序列和Bet/ProT2蛋白質結構進行了分析，同時采用根瘤農桿菌介導的方法，將攜帶有gfp報告基因的35S-B

3、et/ProT2-GFP融合質粒轉化洋蔥表皮細胞，根據(jù)GFP蛋白在激發(fā)光下發(fā)出的綠色熒光來確定Bet/ProT2蛋白的亞細胞定位。并且進一步利用農桿菌介導法將Bet/ProT2轉入粳稻日本晴愈傷組織中，經過抗性篩選，煉苗，大田繁殖得到T2代再生苗。最后通過DNA及RNA水平的PCR鑒定再生苗并經H2O2的組織化學測定及150mmol/L NaCl的鹽脅迫檢測轉基因水稻的耐鹽能力。本研究旨在通過基因工程的手段提高水稻的耐鹽性，為研究Bet

4、/ProT2基因的耐鹽機理奠定基礎。研究結果表明:
　　 在NCBI上查到Bet/ProT2基因（登錄號AB075903）CDS區(qū)長1344bp。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，Bet/ProT2基因CDS區(qū)長1344bp。Bet/ProT2蛋白含有447個氨基酸殘基，相對分子量為48647.9KDa,理論等電點PI=9.4，帶正電荷，為疏水性蛋白質。通過氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，Bet/ProT2蛋白氨基酸序列與其擬南芥中3個脯氨酸轉運子

5、AtProT1、AtProT2、AtProT3同源性分別為73％、71％、71％;與馬鈴薯2個脯氨酸轉運子LeProT1、LeProT2的同源性分別為65％、67％;與甜菜中甜菜堿/脯氨酸轉運子BvBet/ProT同源性為71％。從而可推測Bet/ProT2蛋白與甜菜堿/脯氨酸的轉運具有一定的關系。該蛋白有11個跨膜區(qū);同時亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在葉綠體，線粒體，含有信號肽以及在其他位置的可能性分別為:0.054，0.121，0.

6、032，0.949。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察，只含35S-GFP的表達載體的洋蔥表皮細胞在細胞質膜和細胞內都有綠色熒光;而含有35S-Bet/ProT2-GFP融合表達載體的農桿菌侵染的洋蔥表皮細胞只有細胞質膜上有綠色熒光的分布。通過試驗的手段說明了Bet/ProT2蛋白為定位于細胞質膜上的跨膜蛋白。結合生物信息學分析和亞細胞定位試驗說明，Bet/ProT2蛋白為一個定位在細胞質膜上的甜菜堿/脯氨酸轉運蛋白。
　　 PCR鑒定結

7、果表明Bet/ProT2基因已經整合到5個T2代株系的日本晴粳稻的基因組中且得到了表達。對轉Bet/Pro T2基因水稻T2代的分析表明，Bet/Pro T2基因對水稻在正常條件下的生長沒有顯著影響，但由于Bet/Pro T2基因的過表達，轉基因植株可以有效利用外界存在的甜菜堿和脯氨酸促進植株生長，表現(xiàn)出比野生型更好的長勢。在不存在甜菜堿/脯氨酸的條件下，轉基因植株并沒有表現(xiàn)出更強的耐鹽能力，而在甜菜堿和脯氨酸單獨或同時存在時，和野生型