核黃素與生長素對煙草系統(tǒng)性獲得抗性的調(diào)控作用.pdf

1、核黃素通過生物合成與代謝途徑上的多個環(huán)節(jié)來影響植物生長發(fā)育和抗病防衛(wèi)反應，特別是對植物系統(tǒng)性獲得抗性(systemacquiredrestance，SAR)發(fā)生調(diào)控作用。生長素調(diào)控植物生長發(fā)育的不同過程，通過抑制SAR抑制植物對病原物的抗性。本博士論文通過三項研究，試驗解析核黃素與生長素對SAR調(diào)控呈現(xiàn)相反作用的分子機理。首先，把水稻(Oryzasativa)中催化核黃素合成反應過程最后一步的核黃素合酶(riboflavinsyntha

2、se，RS)與倒數(shù)第二步的2，4-二氧四氫喋啶合酶(lumazinesynthase，LS)引入煙草(Nicotianatobacum)，它們在煙草中異源表達以后，導致核黃素含量升高，煙草生長加快，抗病性增強。其次，通過對煙草體細胞無性系變異產(chǎn)生的組成性表達SAR的煙草突變體ces1-1的研究，發(fā)現(xiàn)生長素和生長素抑制蛋白NtAPR1對調(diào)控煙草的生長和防衛(wèi)都起重要作用。然后，通過T-DNA插入，產(chǎn)生了煙草突變體121-3，鑒定結(jié)果顯示其生

3、長性狀不變，但抗病性增強，說明調(diào)控抗病性的某個基因受到了影響。這些研究結(jié)果初步解析了核黃素與生長素交叉調(diào)控植物生長與抗病防衛(wèi)反應的機制，下面分別加以簡介。
　　1.煙草表達水稻RS基因?qū)ιL與抗病性的影響
　　核黃素合酶(RS)催化核黃素合成過程的最后一步，對核黃素合成起決定性的作用。細菌和酵母很多的RS基因得到克隆，植物上研究甚少。本實驗室克隆的水稻RS基因，與其他一些生物中已克隆到的RS基因在核苷酸序列和氨基酸序列上都沒

4、有同源性。為了深入了解在植物體內(nèi)RS所發(fā)揮的功能，我們將水稻的RS基因在煙草體內(nèi)異源表達，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草(RSETT)，表達RS的轉(zhuǎn)基因煙草(RSETT)生長加快，生長相關基因NtEXP1、NtEXP2表達水平升高，對TMV的抗性增強。抗病防衛(wèi)相關基因PR-1a、PR-1b的檢測結(jié)果顯示，在RSETT中PR-1a，PR-1b的表達顯著增強，與其抗病表型相一致。接種TMV于不同時間點取煙草葉片檢測其活性氧，結(jié)果顯示隨時間增加WT煙草活性

5、氧產(chǎn)生量大于RSETT煙草，表明水稻RS削弱了煙草積累活性氧(ROS)的能力，檢測過敏性細胞死亡(PCD)標志性基因hin1和hsr203，與野生型煙草中的表達量相比，二者在轉(zhuǎn)基因的煙草中表達較弱。另外，測定了RSETT內(nèi)源黃素(Flavins)(游離態(tài)核黃素、FMN和FAD)含量，以及乙烯（ET)的釋放量，其產(chǎn)量均高于WT植株。同時，檢測乙烯信號通路中的相關基因ETR1，CTR1，ERF1，結(jié)果，RSETT的乙烯信號增強。
　　

6、2.煙草表達水稻LS基因?qū)ιL與SAR的影響
　　2，4-二氧四氫喋啶合酶(LS)是生物體內(nèi)合成核黃素的關鍵催化酶，催化合成途徑倒數(shù)第二步反應，決定著生物體內(nèi)的核黃素的含量。核黃素是一種多功能性的維生素，對動植物、微生物的生長發(fā)育以及抗病防衛(wèi)反應都具有很重要的作用。本實驗室從水稻中克隆到的LS基因，與高等植物的LS基因同源性較高。研究將水稻LS基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得異源表達LS的轉(zhuǎn)基因煙草(LSETT)。同野生型煙草(WT)相比，LS

7、ETT生長加快，相關基因NtEXP1、NtEXP2表達量升高，對煙草花葉病毒病(tobaccomosaicvirus,TMV)、空莖病菌(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovor，Pcc)及煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)的抗性增強，抗病防衛(wèi)相關基因PR-1a、PR-1b、NPR1和GST1的表達均顯著增強。使用DAB染色的方法檢測煙草葉片中的

8、活性氧，隨時間增長，LSETT體內(nèi)活性氧積累量低于WT。檢測轉(zhuǎn)基因煙草中細胞死亡情況，發(fā)現(xiàn)LSEST與WT無差異，PCD標志基因hin1和hsr203表達與其表型一致。測定LSETT和WT中黃素(游離態(tài)核黃素、FMN和FAD)含量，結(jié)果顯示核黃素含量在轉(zhuǎn)基因煙草中顯著升高。此外，為了研究水稻LS如何參與調(diào)控煙草抗病性，以及通過何種信號通路實現(xiàn)，我們測定乙烯、茉莉酸（JA）含量，發(fā)現(xiàn)LSETT體內(nèi)乙烯、茉莉酸含量顯著高于野生型。進一步檢測

9、了乙烯、茉莉信號傳導通路五個關鍵性標志基因的表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草的這兩個信號表現(xiàn)增強。
　　3.生長素對煙草SAR的調(diào)控作用
　　生長素(Auxin)在植物的整個生命周期中自始至終發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，生長素信號通路與其它植物激素通路相交叉，以確保植物體正常的生長發(fā)育。為了研究生長素對植物生長與SAR的交叉調(diào)控作用，本實驗室對野生型煙草進行體細胞無性系變異處理，得到了組成性表達系統(tǒng)性獲得抗性的煙草突變體ces1-1。本研究對此

10、煙草突變體進行深入研究，ces1-1表現(xiàn)生長緩慢植株矮化，不能表達與生長途徑相關的NtEXP1和NtEXP2基因，而對病原菌的抗性增強，防衛(wèi)反應基因PR-1a，Chia5，hin1和hsr203組成性表達。突變體ces1-1與野生型WT煙草的RNA差異顯示分析，相差一個與編碼生長素抑制蛋白的基因(NtARP1)一致的轉(zhuǎn)錄本，WT中該基因不轉(zhuǎn)錄。利用cDNA末端快速擴增的方法克隆到ces1-1中的NtARP1基因，生長素處理，ces1-1

11、的NtARP1表達和蛋白產(chǎn)生受到抑制，亞細胞定位檢測，發(fā)現(xiàn)NtARP1定位于突變體ces1-1的細胞核上。利用病毒介導的RNAi的方法將NtARP1沉默，ces1-1生長和抗病防衛(wèi)反應表型特征均恢復到野生型水平，表明NtARP1在調(diào)控煙草的生長防衛(wèi)過程中發(fā)揮著重要作用。檢測ces1-1內(nèi)源生長素含量，發(fā)現(xiàn)其含量低于野生型，外部施用生長素，則含量恢復到野生型水平，并且可以使ces1-1無論生長表型，還是組成性SAR的表型均恢復到野生型狀態(tài)

12、。這些結(jié)果表明，生長素既影響植物生長，也影響抗病防衛(wèi)反應能力，應該存在一個生長素的信號通路，對于調(diào)控植物生長和調(diào)控植物防衛(wèi)呈現(xiàn)拮抗效果。
　　4.煙草抗病性突變體121-3的特性與突變基因分析
　　農(nóng)桿菌介導T-DNA插入植物基因組產(chǎn)生突變體的技術，對于突變體研究以及基因功能鑒定極為有效，這種技術在擬南芥、煙草、水稻等植物研究中得到了廣泛應用，并建立起許多T-DNA標簽插入突變體庫。本研究對使用T-DNA插入獲得的表現(xiàn)組成性

13、SAR的煙草突變體121-3及其突變基因NtTIA進行分析研究。突變體121-3表現(xiàn)表型無變異，抗病性顯著增強。可見，T-DNA的插入改變了煙草體內(nèi)與抗病相關的基因表達，激活了抗病防衛(wèi)反應。通過熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)，得到T-DNA的右邊界（RB）旁側(cè)植物基因組DNA序列(281bp)，初步確定了T-DNA在煙草基因組中的插入位置。該DNA序列在突變體中被激活表達，斷定其是與突變體抗病性改變相關的功能片段，我們將這段序列

14、命名為NtTIA。為得到NtTIA完整的開放閱讀框(ORF)，采用cDNA末端快速擴增(RACE)方法擴增NtTIA的3'端和5'端的表達序列，結(jié)果在其3'端最終得到1230bp的片段，是煙草基因組序列，而5'端擴增到的則是載體上T-DNA區(qū)域的序列，這與T-DNA插入原理是一致的。對NtTIA對于煙草抗病性調(diào)控作用進行研究，NtTIA在121-3突變體中組成性轉(zhuǎn)錄表達。病原菌侵染誘導NtTIA表達增強，可見，NtTIA與突變體抗病性密

15、切相關。而它是通過何種途徑來調(diào)控煙草抗病性，與哪種信號通路相關？我們對其施用激素SA、JA、ET、IAA和ABA分別處理，發(fā)現(xiàn)在野生型煙草中NtTIA依然沒有轉(zhuǎn)錄表達，而在121-3突變體中，SA誘導NtTIA表達減弱，JA誘導NtTIA表達增強，推斷NtTIA可能參與SA和JA信號傳導通路中的抗病防衛(wèi)機制，有待于進一步的研究。
　　結(jié)論
　　第一，水稻RS在煙草體內(nèi)異源表達后，影響乙烯與ROS信號傳導，交叉調(diào)控煙草生長與抗