胸腺素β4對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、胸腺素β4(Thymosin beta4，Tβ4)能夠促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)和毛囊發(fā)育，然而其作用機(jī)制尚不明確。我們構(gòu)建Tβ4表皮特異性過(guò)表達(dá)小鼠模型和全身性敲除小鼠模型，進(jìn)一步研究Tβ4對(duì)毛囊發(fā)育與毛發(fā)生長(zhǎng)的影響，并探索其作用機(jī)制。設(shè)計(jì)合適的靶位點(diǎn)和DNA識(shí)別序列，構(gòu)建TALEN基因敲除載體。分別用TALEN基因敲除載體和表皮特異性載體的表達(dá)框進(jìn)行原核注射，制備Tβ4敲除小鼠和表皮特異性過(guò)表達(dá)小鼠。通過(guò)脫毛實(shí)驗(yàn)比較三組小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)速度。取脫毛

2、部位皮膚組織做石蠟切片，通過(guò)H&E染色觀察毛囊分布，統(tǒng)計(jì)毛干數(shù)目;通過(guò)Tβ4蛋白免疫熒光染色，觀察皮膚中Tβ4蛋白分布情況。通過(guò)real-time PCR和western blotting技術(shù)檢測(cè)上述樣品中Tβ4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和鈣粘蛋白(E-cad)的mRNA和蛋白表達(dá)水平，接著檢測(cè)Wnt、MAPK和PI3K信號(hào)通路的活性，探索Tβ4影響毛發(fā)生長(zhǎng)的作用機(jī)制。
　　1、TALEN基因

3、敲除載體和表皮特異性過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
　　根據(jù)Tβ4的編碼序列(CDs)設(shè)計(jì)合適的靶位點(diǎn)和DNA識(shí)別序列，構(gòu)建TALEN基因敲除載體。用構(gòu)建好的6組TALEN敲除載體轉(zhuǎn)染小鼠NIH3T3細(xì)胞，從中篩選出打靶效率最高的一組L1×R3，打靶效率為93％，進(jìn)行原核注射，制備Tβ4全身性敲除小鼠。將pODsRed-KTP1載體上包含Krt14啟動(dòng)子、Tβ4的CDs區(qū)和polyA序列的片段（KTP片段）切下并純化后，進(jìn)行原核注射制備Tβ4表

4、皮特異性過(guò)表達(dá)小鼠。
　　2、Tβ4敲除小鼠和過(guò)表達(dá)小鼠的制備
　　原核注射時(shí)，225枚注射后胚胎移植到7只受體鼠體內(nèi)，得到40只新生小鼠，其中3只Tβ4表皮特異性過(guò)表達(dá)小鼠，陽(yáng)性率分別為7.5％;127枚注射后胚胎移植到5只受體鼠體內(nèi)，得到25只新生小鼠，其中8只敲除小鼠，突變率為32％。
　　3、Tβ4對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響
　　用松香蠟對(duì)8-10周齡的野生型小鼠、Tβ4全身性敲除小鼠和表皮特異性過(guò)表達(dá)小鼠進(jìn)行

5、脫毛實(shí)驗(yàn)，刺激毛發(fā)同步生長(zhǎng)。在三組實(shí)驗(yàn)小鼠脫毛后第11天拍照，記錄毛發(fā)的生長(zhǎng)情況。觀察發(fā)現(xiàn):野生型小鼠脫毛后第13天、Tβ4敲除小鼠脫毛后第16天和過(guò)表達(dá)小鼠脫毛后第11天，其脫毛部位毛發(fā)生長(zhǎng)情況相同。取三組小鼠脫毛部位的皮膚，制作石蠟切片并進(jìn)行Tβ4蛋白免疫熒光染色和H&E染色，觀察Tβ4在小鼠皮膚中的分布情況和其對(duì)毛囊排列方式和毛干數(shù)目的影響。與野生型小鼠相比，Tβ4過(guò)表達(dá)小鼠長(zhǎng)毛速度最快、被毛較長(zhǎng)且厚，而全身性敲除小鼠長(zhǎng)毛速度較慢

6、并且被毛沒(méi)有長(zhǎng)出體表。H&E染色與免疫熒光染色的結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠的毛囊獨(dú)立地分布，Tβ4只分布在毛囊周?chē)募?xì)胞中;而Tβ4過(guò)表達(dá)小鼠的毛囊成簇生長(zhǎng)，毛干數(shù)目顯著提高，Tβ4幾乎分布于整個(gè)皮膚中;Tβ4敲除小鼠的毛囊獨(dú)立地排列，與對(duì)照組小鼠相比毛干數(shù)目顯著減少，且在毛囊周?chē)?xì)胞與組織中未見(jiàn)Tβ4的分布。
　　4、Tβ4影響毛發(fā)生長(zhǎng)的作用機(jī)制
　　與對(duì)照組相比，Tβ4過(guò)表達(dá)小鼠體內(nèi)Tβ4的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量升高(P

7、＜0.05)，VEGF和MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平也增加(P＜0.05)，而E-cad的mRNA水平和蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(P＞0.05);在敲除小鼠體內(nèi)VEGF和MMP-2的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，E-cad的表達(dá)水平保持穩(wěn)定(P＞0.05)。Wnt信號(hào)通路中β-catenin和LEF-1蛋白表達(dá)量的變化與Tβ4表達(dá)水平的變化趨勢(shì)一致。在過(guò)表達(dá)小鼠體內(nèi)，與對(duì)照組相比P38、ERK1/2和AKT的蛋白表達(dá)量以及磷酸化

8、水平均提高;在敲除小鼠體內(nèi)P38、ERK1/2和AKT的蛋白表達(dá)量顯著降低，而只有ERK1/2的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。
　　綜上所述，我們認(rèn)為在成熟小鼠皮膚中，Tβ4通過(guò)Wnt/β-catenin/LEF-1信號(hào)通路，調(diào)控VEGF和MMP-2的表達(dá)。兩方面相互促進(jìn)共同作用，進(jìn)一步影響MAPK/P38、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT途徑活性的改變，調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)速度、毛干的數(shù)目與毛囊分布，最終影響毛囊生長(zhǎng)發(fā)育。