小鼠胸腺及其對異種抗原細胞的應(yīng)答.pdf

1、研究背景與目的
　　胸腺是哺乳動物的中樞免疫器官，是T細胞分化發(fā)育和成熟的場所，胸腺為T細胞發(fā)育提供了一個縝密而復(fù)雜的微環(huán)境，有序的調(diào)控T細胞的發(fā)育成熟和遷移。胸腺基質(zhì)細胞、可溶性分子以及細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成T細胞發(fā)育的胸腺微環(huán)境。胸腺基質(zhì)細胞間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅起網(wǎng)狀支架作用，而且由于這些細胞表面攜帶大量表面分子、并可以分泌多種胸腺激素和細胞因子，從而為胸腺細胞的發(fā)育和成熟提供合適的微環(huán)境。T細胞在胸腺內(nèi)經(jīng)歷TCR重排，陽性

2、選擇和陰性選擇等發(fā)育過程最終發(fā)育為成熟的T淋巴細胞并遷移到外周免疫器官。
　　根據(jù)傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性中樞耐受的理論機制，如果T細胞發(fā)育過程中在胸腺內(nèi)接觸到異基因的抗原，則會被誘導(dǎo)出對該異基因外周移植物的耐受，同時，血-胸腺屏障使血液中的大分子物質(zhì)包括外來抗原不能進入胸腺，所以胸腺內(nèi)注射異基因抗原可以躲過免疫監(jiān)視，誘導(dǎo)出對異基因抗原耐受的T細胞。為了探索異種抗原細胞在機體內(nèi)的生物學(xué)特性及機體產(chǎn)生的免疫耐受和免疫排斥情況，我們將作為異種不同

3、組織的、MHC差異較大的抗原人肝癌細胞Hep-G2注射到10-15d的C57BL/6小鼠的胸腺中，動態(tài)觀察小鼠胸腺對其發(fā)生的應(yīng)答，進而了解抗原在小鼠胸腺微環(huán)境中對T細胞發(fā)育的影響及胸腺內(nèi)可能發(fā)生的免疫應(yīng)答機制和外源人肝癌細胞對胸腺微環(huán)境及T細胞發(fā)育分化的影響，以及異種人肝癌細胞在小鼠胸腺內(nèi)的命運。
　　研究方法
　　1.小鼠胸腺內(nèi)注射及注射對小鼠胸腺造成的組織病理變化分析
　　1)小鼠胸腺發(fā)育情況分析;
　　2)

4、細胞培養(yǎng)與DiI標(biāo)記;
　　3)胸腺內(nèi)注射方法的簡化;
　　4)注射效率的評估:解剖學(xué)觀察判斷及FCM分析檢測注射效率;
　　5)注射后小鼠體重變化分析與注射方法對小鼠的損傷評估;
　　6)石蠟切片制作與HE染色觀察:
　　2.小鼠胸腺對異種抗原細胞的應(yīng)答
　　1)人肝癌細胞培養(yǎng)與DiI標(biāo)記;
　　2)小鼠胸腺內(nèi)注射入肝癌細胞;
　　3)小鼠胸腺組織稱重及胸腺細胞絕對值計數(shù);
　　4

5、)石蠟切片制作與HE染色觀察胸腺組織病理變化;
　　5)FCM分析胸腺內(nèi)各類細胞亞群比例的變化（T細胞、NK/NKT細胞及調(diào)節(jié)性細胞）;
　　6)FCM分析胸腺細胞凋亡情況;
　　研究結(jié)果
　　第一部分:小鼠胸腺發(fā)育情況分析
　　小鼠在青春期前快速生長和發(fā)育，到青春期時達到一個頂峰，在此之后便開始萎縮;小鼠胸腺的體積也隨年齡增長而變化。
　　Dil染色標(biāo)記觀察
　　Hep-G2人肝癌細胞在含有2

6、0ug/mlDiI的基本培養(yǎng)基中標(biāo)記30min后，細胞標(biāo)記成功，并發(fā)射出強烈的紅色熒光。
　　注射效率評估
　　通過解剖學(xué)觀察，成鼠組的注射成功率為81.47％，乳鼠組的注射成功率為76％，F(xiàn)CM分析的結(jié)果證實此種注射方法基本能夠保證注射的準(zhǔn)確性。
　　注射方法對小鼠損傷程度的評估
　　通過對注射后小鼠行為及體重的變化分析，我們發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組小鼠在體重和行為上均未表現(xiàn)出明顯變化，由此我們認為此注射方法對小鼠的

7、損傷程度很小，值得應(yīng)用和推廣。
　　石蠟切片HE染色觀察結(jié)果
　　Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)遭遇到淋巴細胞的攻擊與殺傷，注射后3d就檢測到淋巴細胞的浸潤及巨噬細胞的募集;注射后7d，大部分的腫瘤細胞已經(jīng)死亡，腫瘤細胞周圍密集大量的淋巴細胞;注射后14d，已經(jīng)檢測不到存活的腫瘤細胞，腫瘤細胞形態(tài)模糊，周圍大量淋巴細胞密集;注射后21d和28d，已經(jīng)檢測不到腫瘤細胞的存在。
　　第二部分:胸腺重量及胸腺細胞總數(shù)變化
　

8、　相比于平行對照組，胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞后7d，14d及21d實驗組小鼠的胸腺重量明顯增加，而此時的胸腺細胞總數(shù)卻明顯減少。
　　小鼠胸腺組織有一定損傷
　　注射后3d檢測到注入人肝癌細胞的胸腺組織區(qū)域有機械損傷的跡象，有的能明顯看出是注射針在胸腺內(nèi)入針時造成的機械損傷，有些則為細胞懸液及注射針推力共同作用的結(jié)果。
　　小鼠胸腺組織皮質(zhì)與髓質(zhì)比例變化
　　胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞后3d，檢測到胸腺內(nèi)腫瘤細胞密集的區(qū)域

9、為大面積的髓質(zhì)區(qū)，而注射后14d的結(jié)果顯示髓質(zhì)區(qū)明顯增加，而皮質(zhì)區(qū)卻很少。胸腺上皮細胞變化
　　小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細胞后，梭形上皮細胞聚集并環(huán)繞在腫瘤細胞周圍，注射后16d上皮細胞非常密集并環(huán)繞腫瘤細胞殘骸形成橢圓形結(jié)構(gòu)，注射后21d和28d數(shù)層鱗狀上皮細胞環(huán)繞圍成同心圓結(jié)構(gòu)包繞腫瘤細胞殘骸，注射后2個月胸腺組織恢復(fù)正常。胸腺內(nèi)注射后，在小鼠胸腺組織空隙的地方檢測到上皮細胞的富集，提示上皮細胞參與了胸腺組織的重建過程。
　

10、　FCM檢測胸腺內(nèi)各類細胞亞群變化
　　與對照組小鼠相比，注射Hep-G2后1周的小鼠胸腺內(nèi)CD4CD8雙陽性細胞比例明顯減少，CD4CD8雙陰性細胞、CD4/CD8單陽性細胞及NKT細胞的比例有明顯升高現(xiàn)象;注射后2周檢測到調(diào)節(jié)性T細胞的比例也有增高的現(xiàn)象;注射后3周胸腺內(nèi)T淋巴細胞、NK/NKT細胞的比例未見有明顯變化;
　　胸腺細胞凋亡檢測
　　胸腺內(nèi)注射Hep-G2后1周，實驗組小鼠胸腺細胞的凋亡率有明顯升高現(xiàn)

11、象，注射后3周凋亡率沒有明顯變化。
　　研究結(jié)論
　　1.通過對小鼠胸腺內(nèi)注射方法進行簡化，我們構(gòu)建了一種簡單的小鼠胸腺內(nèi)注射的方法用于動物實驗的研究。
　　2.明確了異種人肝癌細胞Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)被免疫細胞攻擊與清除的命運，并初步確定巨噬細胞、NK細胞及成熟的T淋巴細胞均參與了Hep-G2細胞的免疫攻擊與清除。
　　3.Hep-G2的注入，對小鼠胸腺組織造成一定的病理損傷，包括注射造成的胸腺組織機械損傷