小鼠胸腺T細胞淋巴瘤模型的建立.pdf

1、【目的】 通過腹腔注射DNA烷化劑N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴瘤，建立相應(yīng)動物模型；應(yīng)用組織形態(tài)學(xué)、免疫表型、超微結(jié)構(gòu)觀察及巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法鑒定腫瘤細胞來源并分型。 【方法】 1.第一部分，選用6～8周齡C57BL/6小鼠52只，隨機分實驗組40只和對照組12只。實驗組小鼠腹膜腔內(nèi)注射新鮮配制MNU誘導(dǎo)液(50mg/kg體重)；對照組腹膜腔內(nèi)注射等量生理鹽水，共注射2次(分別于第

2、0、8周)。注射后觀察動物一般情況，對瀕死及死亡小鼠進行解剖觀察。第22周采用頸椎脫位法處死全部小鼠，解剖檢查胸腺淋巴瘤的發(fā)生及其他臟器情況。 2.第二部分，應(yīng)用光鏡和透射電鏡，對誘發(fā)的胸腺淋巴瘤及其侵襲臟器進行研究，分析其組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)特點。通過免疫組織化學(xué)方法(所選抗體有CD3、CD20、FdT及PCNA)鑒定腫瘤細胞來源、分型。 3.第三部分，采集8例實驗組胸腺淋巴瘤組織及4例對照組胸腺組織，迅速放入液氮罐內(nèi)，后

3、置入-70℃冰箱凍存。提取基因組DNA，采用巢式PCR方法，對采集樣本進行T細胞受體β鏈(TCRβ)和γ鏈(TCRγ)克隆性基因重排分析，并對TCRγ基因重排的PCR產(chǎn)物直接測序。 【結(jié)果】 1.實驗后期，實驗組小鼠體重明顯下降。第22周，67.5％(27/40)實驗組小鼠產(chǎn)生胸腺淋巴瘤。不同性別對成瘤率影響無明顯差異。77.8％胸腺淋巴瘤合并其他臟器侵犯。 2.27例胸腺淋巴瘤光鏡下主要表現(xiàn)為：胸腺結(jié)構(gòu)破壞，代

4、之以彌漫分布的中等大小淋巴樣細胞，細胞形態(tài)比較一致，胞質(zhì)稀少，核圓形、卵圓形或扭曲核，染色質(zhì)細膩，核仁顯著，核分裂象多見，可見“星空”現(xiàn)象。免疫組化顯示瘤細胞表達CD3和TdT。超微結(jié)構(gòu)觀察，瘤細胞平均直徑7.02±1.12μm，表面無突起，核形相對規(guī)則或伴有扭曲核，核仁靠近核膜，核漿比例高，胞質(zhì)內(nèi)細胞器極少，凋亡細胞易見。 3.8例胸腺淋巴瘤檢測TCRβ和TCRγ均呈克隆性基因重排，陽性率100％；4例對照組胸腺組織均未檢測到

5、TCRβ或TCRγ克隆性基因重排。DNA序列測定證實TCRγ基因PCR擴增產(chǎn)物為基因重排產(chǎn)物。 【結(jié)論】 1.腹腔分次注射MNU可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生胸腺淋巴瘤，其生物學(xué)行為與人類腫瘤相似。 2.結(jié)合光鏡、免疫組化和電鏡檢查結(jié)果，證實所有腫瘤為胸腺T淋巴細胞起源的前驅(qū)淋巴母細胞淋巴瘤。 3.巢式PCR TCRβ和TCRγ的基因重排檢測及DNA序列分析證實，MNU誘導(dǎo)的小鼠胸腺淋巴瘤實際上是T淋巴細胞的單克隆性增