小鼠胸腺T細(xì)胞淋巴瘤模型的改進(jìn)及治療的初步研究.pdf

1、目的：本課題旨在通過(guò)調(diào)整給藥方案和實(shí)驗(yàn)周期，進(jìn)一步提高N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴瘤模型的成瘤率并降低死亡率；利用此種動(dòng)物模型，采用原代培養(yǎng)方法，以期建立一個(gè)新的淋巴瘤細(xì)胞系/株；以小鼠T淋巴瘤細(xì)胞株EL-4細(xì)胞株為模型，研究淫羊藿素(ICT)是否抑制其增殖，并就其作用機(jī)制做初步探討；研究ICT是否抑制MNU誘導(dǎo)小鼠胸腺T細(xì)胞淋巴瘤的裸鼠移植瘤的增殖。 方法： 1.第一部分，選用6～8周齡C57BL/

2、6小鼠80只，隨機(jī)分實(shí)驗(yàn)組66只，對(duì)照組14只。根據(jù)體重于第1周腹腔內(nèi)注射MNU誘導(dǎo)液，分為3個(gè)劑量組(G1、G2、G3)，劑量分別為50、50、100mg/kg體重；對(duì)照組(GO)14只，經(jīng)腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水(50mg/kg體重)。第5周，G1、G2實(shí)驗(yàn)組第2次經(jīng)腹腔內(nèi)注射MNU誘導(dǎo)液，劑量分別為50、70mg/kg體重；對(duì)照組(GO)與G3實(shí)驗(yàn)組經(jīng)腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水(50mg/kg體重)。注射后觀察動(dòng)物一般情況，對(duì)瀕死及死亡

3、小鼠進(jìn)行解剖觀察。第25周采用頸椎脫位法處死全部小鼠，解剖檢查胸腺淋巴瘤的發(fā)生及其他臟器情況。應(yīng)用光鏡和免疫組織化學(xué)方法(所選抗體有CD3、CD20、TdT及PCNA)，對(duì)誘發(fā)的胸腺淋巴瘤及其侵襲臟器進(jìn)行研究并鑒定腫瘤細(xì)胞來(lái)源、分型。 2.第二部分，在第一部分誘導(dǎo)的胸腺淋巴瘤模型基礎(chǔ)上，采用胰蛋白酶消化法、機(jī)械分散法獲取腫瘤細(xì)胞混懸液，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)。 3.第三部分，研究ICT體外對(duì)EL-4細(xì)胞作用及機(jī)制：應(yīng)用MT

4、T比色法檢測(cè)ICT對(duì)EL-4細(xì)胞增殖能力的影響；應(yīng)用透射電鏡技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ICT對(duì)EL-4細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ICT作用后EL-4細(xì)胞Bcl-2、P21基因mRNA表達(dá)水平的改變；通過(guò)比色法檢測(cè)ICT作用后對(duì)EL-4細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響。 4.第四部分，建立MNU誘導(dǎo)小鼠胸腺T細(xì)胞淋巴瘤的裸鼠異種移植瘤模型，研究ICT對(duì)移植瘤的作用。設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照組，環(huán)磷酰胺陽(yáng)性

5、對(duì)照組及ICT高、中、低三個(gè)濃度組，每組5只裸鼠。高、中、低濃度組分別按每只每次腹腔注射ICT0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg進(jìn)行給藥，陰性對(duì)照組注射等量生理鹽水，每天給藥一次，連續(xù)10天。陽(yáng)性對(duì)照組每只每次腹腔注射10mg/ml，0.2ml(共2mg)環(huán)磷酰胺，隔天給藥一次，共3次。末次給藥后24小時(shí)，處死裸鼠。稱量離體瘤塊重量、計(jì)算抑瘤率，對(duì)瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，檢測(cè)ICT對(duì)裸鼠異種移植

6、瘤生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果： 1.第25周，83.3％(55/66)實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生胸腺淋巴瘤；包括5只死亡小鼠，死亡率7.6％。55例胸腺腫瘤光鏡下主要表現(xiàn)為：胸腺結(jié)構(gòu)破壞，代之以彌漫分布的中等大小淋巴樣細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)一致，胞質(zhì)稀少，核圓形、卵圓形，染色質(zhì)細(xì)膩，核仁顯著，核分裂象多見(jiàn)，可見(jiàn)“星空”現(xiàn)象。免疫組化顯示瘤細(xì)胞表達(dá)CD3和TdT。 2.采用胰蛋白酶消化法、機(jī)械分散法獲取腫瘤細(xì)胞混懸液。接種48h后活細(xì)胞率由9

7、8％±1.5％降低為30％±3％，無(wú)法傳代及繼續(xù)培養(yǎng)。 3.ICT對(duì)EL-4細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用：MTT比色法試驗(yàn)顯示ICT能明顯抑制EL-4細(xì)胞增殖，且隨著藥物濃度的升高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)該抑制作用明顯增強(qiáng)，呈量效及時(shí)效關(guān)系。透射電鏡及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，ICT可誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞凋亡。RT-PCR顯示，以40μmol/L的ICT處理EL-4細(xì)胞6h后，bcl-2、P21基因的mRNA表達(dá)下調(diào)。比色法Caspase-3、C

8、aspase-9酶活性檢測(cè)顯示40、80μmol/L ICT作用6h能夠顯著增強(qiáng)EL-4細(xì)胞Caspase-3酶活性，也可同時(shí)增強(qiáng)Caspase-9酶活性。 4.ICT作用前后，雖然裸鼠移植瘤大小等無(wú)明顯差異，但在光鏡下可觀察到ICT中、高劑量組(1.0mg/kg、1.5mg/kg)中均有1例出現(xiàn)明顯增多的固縮細(xì)胞及較多核碎屑。 結(jié)論： 1.通過(guò)調(diào)整給藥方案和實(shí)驗(yàn)周期后腹腔注射MNU，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生胸腺T細(xì)胞淋巴

9、瘤，成瘤率較之前67.5％提高為83.3％，死亡率較之前10％降低為7.6％。 2.體外原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠胸腺T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤細(xì)胞未獲成功，培養(yǎng)條件及方法尚待摸索。 3.ICT可抑制體外培養(yǎng)的小鼠T淋巴瘤EL-4細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能系通過(guò)下調(diào)bcl-2、P21 mRNA表達(dá)，激活Caspase-3、Caspase-9蛋白等途徑實(shí)現(xiàn)的。 4.ICT體內(nèi)可能誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡，但在劑量及給藥方式上尚待