棉花不成熟纖維突變基因(im)的定位及突變體纖維次生壁加厚期表達譜分析.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟作物。棉纖維是重要的天然紡織原料。它是由胚珠表皮細胞發(fā)育而來的單細胞絨毛。棉纖維的發(fā)育可以分為四個明顯不同但略有重疊的階段:纖維的分化和起始、細胞伸長、次生壁合成和纖維成熟。由于棉纖維在發(fā)育過程中表現(xiàn)出的優(yōu)良特性，被認為是研究細胞伸長和細胞壁生物合成的理想模型。突變體是進行遺傳研究和揭示重要基因分子機制的優(yōu)良材料。不成熟纖維突變體im是棉花中一個特殊的纖維突變體，被認為引起次生壁發(fā)育缺陷。對im突變體的研究將有助于我們更

2、好地理解纖維次生壁發(fā)育的復雜過程，揭示其分子調(diào)控機理，并為棉花纖維品質(zhì)改良貯備一些優(yōu)良基因。本研究以im突變體為研究材料，開展了棉花不成熟纖維突變基因?qū)w維主要品質(zhì)和衣分性狀影響研究，以及與其相關(guān)的棉纖維次生壁表達譜分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過比較im突變體和2個陸地棉纖維發(fā)育正常品系TM-1和I4005的纖維表型，發(fā)現(xiàn)與對照材料相比，棉纖維在im突變體中不蓬松，仍緊縮在種子上。進一步配置im×TM-1和im×I40

3、05雜交組合，發(fā)現(xiàn)所有的F1植株均表現(xiàn)正常蓬松的纖維表型，而F2群體中出現(xiàn)緊縮和正常蓬松2種纖維表型，分離比例符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律。證實im突變體是由一對隱性等位基因控制。
　　 2.利用6713對SSR引物對im突變體和I4005及TM-1進行全基因組掃描。在im突變體和I4005之間共找到257個多態(tài)性標記。其中186個SSR標記產(chǎn)生193個多態(tài)性位點，分布在31個連鎖群上。im基因座和4個SSR標記NAU1190，DP

4、L0170，NAU3995和NAU1197位于同一條連鎖群上。該連鎖群屬于棉花3號染色體(A3)，覆蓋55.5 cM，標記間平均距離為13.9 cM。im基因座兩側(cè)最近的標記為DPL0170和NAU3995，分別相距21.8 cM和32.5 cM。im突變體和TM-1之間僅發(fā)現(xiàn)3個位于A3染色體上的多態(tài)性標記，NAU3639，NAU1190和DPL0170，它們分別與im基因座相距10.2、24.3和23.3 cM。
　　 3.

5、為了進一步精細定位im基因，為圖位克隆該基因奠定基礎。利用以TM-1為背景攜帶海島棉海7124A3染色體片段的3個染色體單片段代換系(CSILs)，CSIL028、CSIL030和CSIL031與im突變體雜交，構(gòu)建了CSIL028×im F2，CSIL030×im F2和 CSIL031×im F2作圖群體。使用棉花公共遺傳圖譜A3連鎖群上的SSR標記在這3個F2群體中分別檢測到47、7和12個SSR多態(tài)性標記。其中，以CSIL028

6、×im F2為作圖群體構(gòu)建的遺傳圖譜最為密集，47個SSR標記聯(lián)同im基因座覆蓋80.9 cM，平均標記間距離1.8 cM。im基因被定位于BNL2443和cgr6528標記之間，分別相距3.6和1.3 cM。在以CSIL030×im F2和CSIL031×im F2為作圖群體構(gòu)建的遺傳圖譜中發(fā)現(xiàn)只有單側(cè)標記與im基因座連鎖，最近的標記NAU5444和NAU3479分別與im基因座相距30.3 cM和40.0 cM。同時連鎖分析顯示CS

7、IL030和CSIL031中所導入的海7124A3染色體片段上不包含im等位基因。
　　 4.通過比較im突變體與I4005、TM-1、CSIL028、CSIL030及CSIL031在纖維品質(zhì)及衣分上的差異，發(fā)現(xiàn)除了短纖維指數(shù)im突變體顯著高于其他5個材料外，在纖維長度、比強度、馬克隆值、成熟度、整齊度和衣分等多個性狀上，im突變體均顯著的低于其他5個材料(P＜0.001)。對5個F2(:)3群體的QTL分析顯示，每個群體中均有

8、多個性狀相關(guān)的QTL成簇分布在im基因座周圍，解釋的表型變異從18.2％～82.03％。利用BioMercator v2.1對這5個群體QTL的meta分析顯示，除了纖維比強度之外，和其他6個性狀相關(guān)的成簇分布在im基因座周圍的QTL均分別是一個一致性QTL。這6個一致性QTL被定位在一個很小的區(qū)間內(nèi)，它們95％的置信區(qū)間分別為1.22、0.72、0.56、0.89、0.76和0.67 cM，兩側(cè)最近的標記均為BNL2443和cgr65

9、28，解釋的平均表型變異為27.16‰69.61％。
　　 5.通過檢測im突變體和TM-1在19、22、25、30、35、40 DPA和成熟期7個纖維不同發(fā)育時期的纖維素含量，結(jié)果顯示，在每個對應的發(fā)育時期，im突變體棉纖維中纖維素含量均顯著低于TM-1。推測im突變體中纖維素的合成可能受到部分抑制。對兩個材料13、19、25 DPA及成熟纖維細胞壁厚度的比較發(fā)現(xiàn)，im突變體25 DPA及成熟纖維的細胞壁厚度顯著低于TM-1，

10、表明im突變體次生壁發(fā)育缺陷，而細胞壁厚度減小可能是由于纖維素減少所導致的。對10、13、16、19、22、25、30、35、40DPA纖維中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的分析發(fā)現(xiàn)，im突變體和TM-1中葡萄糖和果糖變化趨勢非常相似，但在次生壁發(fā)育后期im突變體纖維中的葡萄糖和果糖含量更高。在25～35 DPA期間TM-1纖維細胞中的蔗糖含量顯著高于im突變體。這可能與im突變體和TM-1中不同的纖維素含量相關(guān)。推測在次生壁發(fā)育階段，由于im

11、基因突變影響了纖維細胞中正常的糖代謝過程，im突變體中分配進入纖維素合成途徑的蔗糖可能少于TM-1。
　　 6.利用包含29，184個纖維發(fā)育相關(guān)探針的cDNA芯片對im突變體和TM-1在13、16、19、22和25 DPA不同纖維發(fā)育時期以及材料間的表達譜進行比較分析。對相鄰時間點的基因差異表達比較顯示，13～16，16～19，19～22 DPA相鄰時間點中在TM-1中的差異表達基因（foldchange＞2倍，F(xiàn)DR＜0.0

12、5）數(shù)目均高于im突變體。特別是在纖維發(fā)育的13～16 DPA階段，在im突變體中僅檢測到98個差異基因，而在TM-1中檢測到494個。但在纖維發(fā)育22～25 DPA中則剛好相反，在im突變體中檢測到更多的差異表達基因。在im突變體中檢測到236個差異表達基因，而在TM-1中僅檢測到60個。表明兩個材料在相同的發(fā)育階段表現(xiàn)不同的基因表達變異水平，而im突變體前低后高的基因表達變異水平則暗示其可能存在纖維發(fā)育的延遲性。TM-1和im突變體

13、之間基因表達水平變化最大的時期發(fā)生在16 DPA，一共有1308個基因差異表達。表明16 DPA是一個非常重要的纖維發(fā)育時期。進一步對差異表達基因的GO功能注釋及富集分析顯示，和im突變體相比TM-1更早的啟動了纖維次生壁的合成，大致在16 DPA，而im突變體則直到19 DPA才開始啟動次生壁的合成。在16和19DPA，次生壁合成的起始階段，TM-1和im突變體間差異表達基因中富集到的GO大部分涉及糖代謝及細胞壁合成相關(guān)進程。涉及這些

14、進程的部分基因與擬南芥中被證實是次生壁正常發(fā)育所需的基因相似。和im突變體相比，它們在這個階段的TM-1纖維中具有更高的轉(zhuǎn)錄水平。然而在隨后的纖維發(fā)育時期中，這些與糖代謝及細胞壁合成相關(guān)的進程沒有被富集，暗示im基因可能更多的作用于次生壁發(fā)育的早期階段，它很可能是一個參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)碳流進入纖維素合成的調(diào)控基因。
　　 7.利用最近釋放的棉花D基因組序列信息，結(jié)合im基因定位結(jié)果，在包含im基因的區(qū)域內(nèi)預測到了155個基因。根據(jù)表

15、達譜分析結(jié)果，155個基因中僅檢測到8個在TM-1和im突變體之間差異表達，但基因表達水平差異并不很大。GO分析顯示有73個基因參與到不同的生物進程，其中有20個基因參與到信號、生物調(diào)控、生長發(fā)育、再生及糖代謝相關(guān)進程。但這些基因并沒有在芯片表達譜分析中檢測到在TM-1和im突變體之間存在表達差異，這可能與芯片中代表的基因數(shù)有關(guān)。KEGG分析顯示有18個基因參與到不同的代謝途徑，其中糖代謝是最主要的代謝途徑。這些基因在纖維發(fā)育中扮演的角