玉米苗期漬水脅迫誘導(dǎo)根系miRNA快速應(yīng)答機(jī)理的研究.pdf

1、玉米是全世界最重要的糧食、飼料和能源作物之一，也是我國(guó)第一大糧食作物。澇漬是影響熱帶、亞熱帶地區(qū)玉米生產(chǎn)，尤其是苗期土壤漬水，已成為制約我國(guó)南方地區(qū)發(fā)展玉米生產(chǎn)的非生物逆境脅迫因素之一。真核生物基因組內(nèi)存在大量非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)基因，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上，直接參與發(fā)育基因和對(duì)非生物逆境脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)調(diào)控。
　　 本研究選用苗期具有不同耐漬表型的自交系Hz32(高耐漬性)、Mo17(漬

2、害敏感)和B73(中等耐性)為研究材料，分別對(duì)三葉期沙培幼苗進(jìn)行漬水1h、2h、4h的短期漬水脅迫處理，分析對(duì)照與各處理?xiàng)l件下根系miRNA的表達(dá)動(dòng)態(tài)、鑒定特異表達(dá)miRNA的順式作用元件及受其負(fù)調(diào)控的靶基因，旨在揭示玉米苗期在漬水逆境條件下，低氧脅迫誘導(dǎo)根系miRNA快速應(yīng)答的調(diào)控機(jī)理，為闡明玉米苗期耐漬性的分子機(jī)制，為采用分子標(biāo)記輔助選擇策略，選育具有優(yōu)良耐漬性的玉米自交系提供理論依據(jù)。研究工作取得了以下結(jié)果：
　　 1.從

3、高耐漬系Hz32經(jīng)4小時(shí)漬水處理和對(duì)照的根組織樣本中，分離所有小分子RNA(small RNA，smRNA)，采用高通量RNA測(cè)序技術(shù)建立了smRNA文庫(kù)。分別從處理樣品中獲得了9，251，451個(gè)reads，從對(duì)照樣品中獲得了9，541，782個(gè)reads。經(jīng)歸并整理，從這兩個(gè)文庫(kù)中共鑒定了24個(gè)與耐漬相關(guān)的差異表達(dá)miRNA序列(代表著64個(gè)已知的miRNA基因和2個(gè)新miRNA基因)。
　　 2.采用qPCR技術(shù)，對(duì)Hz3

4、2、B73、Mo17三個(gè)自交系的1h，2h，4h漬水處理與對(duì)照根組織樣本，進(jìn)行上述24個(gè)miRNA及其靶基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果表明：24個(gè)miRNA介入了92個(gè)候選靶基因的表達(dá)調(diào)控。其中的miR159、miR164、miR167、miR393、miR408和miR528可能為主要參與根系發(fā)育和漬水脅迫響應(yīng)的miRNA。
　　 3.對(duì)自交系Hz32經(jīng)4h漬水處理及對(duì)照樣本的RNA-seq分析，驗(yàn)證了大部分miRNA靶基因的表達(dá)。

5、而且采用5’-RLM-RACE方法，驗(yàn)證了其中6個(gè)靶基因的miRNA剪切位點(diǎn)。對(duì)miRNA與其靶基因表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行了相關(guān)分析，表明：約有50%的靶基因與其miRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，其中多數(shù)為參與低氧脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。揭示了miRNA作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵因子，在玉米苗期耐漬脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
　　 4.利用JASPAR(http：//jasper.genereg.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的順式元件位置權(quán)重矩陣(PWM

6、，Position Weight Matrix)對(duì)具有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription StartSite，TSS)信息的30個(gè)差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件(cis-motif)分析，共鑒定到18個(gè)與低氧脅迫響應(yīng)及發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。同時(shí)利用本研究構(gòu)建的，含有712個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor，TF)的TF文庫(kù)進(jìn)行酵母單雜交(Yeast One Hybrid，Y1H)的鑒定，