碩士論文——兩種鄰苯二甲酸酯物質(zhì)的抗雄激素作用研究

1、<p>　　兩種鄰苯二甲酸酯物質(zhì)的抗雄激素作用研究</p><p>　　摘 要：目的 探討鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的抗雄激素作用。方法 參照OECD Hershberger試驗(yàn)指南進(jìn)行，以6周齡雄性去勢SD大鼠為試驗(yàn)動物，隨機(jī)分為16組（7只/組），分別以DEHP和DBP為受試物，DEHP劑量分別為35、70、150、250、500、1000 mg/kg.b

2、w，DBP劑量分別為70、150、250、500、750、1000 mg/kg.bw；陰性對照組和陽性對照組分別灌胃給予玉米油和3.0mg/kg.bw氟他胺，連續(xù)10天。灌胃前各組均皮下注射丙酸睪酮。試驗(yàn)結(jié)束后測定陰莖頭、腹側(cè)前列腺、精囊、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量和血清中睪酮、黃體生成素水平。利用基準(zhǔn)劑量分析軟件分析雄激素依賴組織器官重量的劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果 250、500、1000 mg/kg.bw DEHP劑量組腹側(cè)前列腺

3、、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量低于陰性對照,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），500、750、1000 mg/kg.bw DBP劑量組肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），各組間血清激素</p><p>　　關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯；鄰苯二甲酸二丁酯；Hershberger試驗(yàn)；抗雄激素；內(nèi)分泌干擾；基準(zhǔn)劑量；</p><p>

4、;　　Study for anti-androgenic effect of two of Phthalate esters</p><p>　　Abstract：Objective Study the anti-androgenic effect of diethylhexyl phthalate( DEHP ) and Dibutyl phthalate ( DBP ). Methods According

5、to Hershberger bioassay form OECD guideline, 6 weeks old male SD rats were randomly divided into 16 groups, DEHP( 35, 70, 150, 250, 500, 1000 mg/kg.bw) and DBP ( 70, 150, 250, 500, 750, 1000 mg/kg.bw ) were given by oral

6、 gavage, respectively. Meanwhile, coin oil was given by oral gavage as a negative control, and 3.0 mg/kg.bw flutamide was given by oral gavage as</p><p>　　Key words： Diethylhexyl phthalate; Dibutyl phthalate

7、; Hershberger Bioassay; Anti-androgenic; Endocrine-disrupting; Benchmark does</p><p>　　近年來，鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)（Phthalate esters，PAEs）的內(nèi)分泌干擾作用逐漸成了國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。在我國，鄰苯二甲酸二(2-乙基）己酯（diethylhexyl phthalate, DEHP）和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibut

8、yl phthalate, DBP）的使用量占增塑劑的前兩位[]，在食品包裝材料、器皿、醫(yī)療用品、化妝品以及人造革等方面都被廣泛應(yīng)用[-]。2012年和2013年發(fā)生臺灣塑化劑事件和大陸白酒檢出塑化劑事件，這兩種物質(zhì)是主要檢出物質(zhì)，其毒性和健康風(fēng)險備受關(guān)注。</p><p>　　已有研究表明，DEHP、DBP具有不同程度的神經(jīng)毒性、生殖毒性、發(fā)育毒性、免疫毒性、胚胎毒性等毒效應(yīng)[-]。也有研究資料提示該類物質(zhì)可能

9、具有內(nèi)分泌干擾作用[-]。目前對于DEHP和DBP在抗雄激素作用上的研究較少，缺乏抗雄激素作用準(zhǔn)確的毒性參考閾值和劑量-反應(yīng)關(guān)系。</p><p>　　本研究參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織試驗(yàn)指南（OECD TG441）[]，通過Hershberger試驗(yàn)研究DEHP和DBP的抗雄激素作用，利用基準(zhǔn)劑量法分析其劑量-反應(yīng)關(guān)系，并獲得基準(zhǔn)劑量（Benchmark does, BMD）和基準(zhǔn)劑量下限（Benchmark do

10、es lower bound, BMDL）。為探討DEHP和DBP的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及其聯(lián)合作用研究提供科學(xué)依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 試劑與儀器</p><p>　　DEHP、DBP、氟他胺（Flutamide, FT），均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；丙酸睪酮（Test

11、osterone Propionate, TP），購自北京冠星宇科技有限公司；金龍魚玉米胚芽油，購于豐益貿(mào)易（中國）私人有限公司；血清睪酮（Testosterone, T）、黃體生成素（Luteinizing Hormone, LH）放射免疫試劑盒，購于北京北方生物工程研究所；去大豆成分飼料，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。</p><p>　　低速高速離心機(jī)，購于北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；XH-608

12、0伽馬計數(shù)器，購于西安核儀廠；BiotekSynergy 4多功能酶標(biāo)儀，購于基因有限公司；BS423S電子天平，購于賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。</p><p><b>　　1.2 實(shí)驗(yàn)動物</b></p><p>　　SPF級6周齡Sprague Dawley（SD）雄性大鼠112只，體重190-210g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證：

13、SCXK（京）2012-0009]，飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心動物實(shí)驗(yàn)室[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（京）2009-0032]。飼養(yǎng)條件：溫度為20-24℃、濕度為40-70%、動物照度15-20LX、換氣次數(shù)≥15次/h、12h晝夜交替、空氣清潔度7級、噪聲dB（A）≤60。</p><p><b>　　1.3 方法</b></p><p>　　1.3.1 動物

14、分組與處理</p><p>　　參照OECD TG441等[11-][]的方法，SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，觀察無異常，用血管結(jié)扎的方法摘除睪丸和附睪。術(shù)后恢復(fù)1周，將大鼠按照體重隨機(jī)分為8組：1個陰性對照組、1個陽性對照組、6個劑量組。試驗(yàn)分兩次完成，分別為關(guān)于DEHP和DBP的Hershberger試驗(yàn)，將TP、FT、DEHP或者DBP用玉米油溶解為相應(yīng)濃度的溶液，各組均皮下注射0.2mg/kg.bw的TP（皮

15、下注射量為0.5ml/kg），30min后，陰性對照（Solvent control, SC）灌胃（灌胃量為5ml/kg，下同）給予玉米油，陽性對照（Positive control, PC）灌胃給予3mg/kg.bw的FT，DEHP劑量組分別灌胃給予35、70、150、250、500、1000 mg/kg.bw的DEHP，DBP劑量組分別灌胃給予70、150、250、500、750、1000 mg/kg.bw的DBP。連續(xù)給樣品10d

16、，期間每隔24小時稱重且記錄，并以體重調(diào)整灌胃量。</p><p>　　1.3.2 器官稱量和血清睪酮、黃體生成素檢測</p><p>　　最后一次給樣品24h后稱量大鼠體重，并用2%戊巴比妥鈉麻醉。待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將其解剖，經(jīng)腹主動脈采血后，取5個雄激素依賴性組織器官：陰莖頭、腹側(cè)前列腺、精囊、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺，以及肝臟、腎臟、腎上腺稱重（精確到0.001g）并記錄，計

17、算肝臟、腎臟、腎上腺的臟器系數(shù)，臟器系數(shù)公式為：</p><p>　　采用放免法檢測血清中睪酮（T）和黃體生成素（LH）含量，具體操作程序依照相應(yīng)試劑盒說明規(guī)程進(jìn)行。</p><p><b>　　1.4 數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　1.4.1 各組間均值比較</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 表示，應(yīng)用SPS

18、S 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時兩兩比較用LSD法，方差不齊時兩兩比較用Dunnett’sT3法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。</p><p>　　1.4.2 相關(guān)性檢驗(yàn)</p><p>　　應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行兩變量線性相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為通過顯著性檢驗(yàn)。</p&g

19、t;<p>　　1.4.3 BMD法擬合數(shù)據(jù)</p><p>　　使用基準(zhǔn)劑量軟件（Benchmark does software，BMDS）2.6.0中文版（國家食品安全風(fēng)險評估中心）分析DEHP和DBP對雄激素依賴性組織器官重量的劑量-反應(yīng)關(guān)系，根據(jù)指標(biāo)性質(zhì)，選擇合適模型。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為連續(xù)型，可選模型為：指數(shù)模型、希爾模型、線性模型、多項式模型、冪模型。將指標(biāo)參數(shù)納入模型進(jìn)行檢驗(yàn)，當(dāng)劑量-反應(yīng)

20、關(guān)系檢驗(yàn)P1<0.1與擬合優(yōu)度檢驗(yàn)P2>0.1同時滿足時接受該模型，如果多個模型被接受，根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）選擇AIC最小的模型。基準(zhǔn)反應(yīng)（Benchmark response，BMR）選擇10%，擬合推算相應(yīng)的BMD和BMDL,即BMD10和BMDL10。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></

21、p><p>　　2.1 一般觀察和動物體重</p><p>　　大鼠去勢后恢復(fù)良好，活動和進(jìn)食正常。各組在給樣品前、給樣品后體重以及各組大鼠增重差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。</p><p>　　表1 DEHP和DBP對大鼠體重的影響 ( )</p><p>　　Table 1 The influence of DE

22、HP and DBP on body weight change of rats</p><p>　　注：a表示與陰性對照組相比P<0.05。</p><p>　　2.2雄激素依賴性組織器官的重量及比較</p><p>　　由表2可見，與陰性對照相比，250、500、1000 mg/kg.bw DEHP劑量組的大鼠腹側(cè)前列腺、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量，以

23、及1000mg/kg.bw DEHP劑量組的大鼠陰莖頭和精囊重量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與陰性對照相比，500、750、1000mg/kg.bw DBP劑量組的大鼠肛提肌-海綿體肌、尿道球腺重量，以及750、1000mg/kg.bw DBP劑量組的大鼠腹側(cè)前列腺和精囊重量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。</p><p>　　表2 DEHP和DBP對大鼠雄激素依賴性組織器官重

24、量的影響( )</p><p>　　Table 2 The influence of DEHP and DBP on androgen-dependent tissues weights of rats</p><p>　　注：a表示與陰性對照組相比P<0.05。</p><p>　　2.3 其他臟器的臟器系數(shù)及比較</p><p>

25、;　　由表3可見，與陰性對照相比，150、250、500、1000mg/kg.bw DEHP劑量組肝臟系數(shù)，以及500、1000mg/kg.bw DEHP劑量組腎臟系數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中肝臟系數(shù)隨劑量的增加而增加，呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.875，P<0.05）；與陰性對照相比，500、750、1000mg/kg.bw DBP劑量組肝臟系數(shù)，以及750、1000mg/kg.bw DBP劑量組的腎臟系數(shù)升

26、高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中肝臟系數(shù)隨劑量的增加而增加，表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系（r=0.542，P<0.05）。</p><p>　　表3 DEHP和DBP對大鼠其他臟器的臟器系數(shù)影響( )</p><p>　　Table 3 The influence of DEHP and DBP on organ coefficient of rats</p>

27、<p>　　注：a表示與陰性對照組相比P<0.05。</p><p>　　2.4 血清T、LH的測定與比較</p><p>　　血清T、LH測定結(jié)果顯示，陰性對照組、陽性對照組與各受試物劑量組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。(結(jié)果略)</p><p>　　2.5 BMDS分析結(jié)果</p><p>　　BMD分析結(jié)果顯示，雄激素依賴

28、性組織器官的發(fā)育與DEHP、DBP均具有劑量-反應(yīng)關(guān)系(P1<0.1)，相應(yīng)的BMD10和BMDL10見表4。其中，肛提肌-海綿體肌、尿道球腺對DEHP和DBP的反應(yīng)均最為敏感，劑量-反應(yīng)關(guān)系分別見圖1至圖4。按照模型接受擬合優(yōu)度檢驗(yàn)原則，DEHP選擇基于肛提肌-海綿體肌為終點(diǎn)的希爾模型模型，DBP選擇基于尿道球腺為終點(diǎn)的希爾模型模型，兩種物質(zhì)的BMDL10分別為35.87 mg/kg.bw和261.78mg/kg.bw。<

29、/p><p>　　表4 DEHP、DBP導(dǎo)致不同終點(diǎn)的BMD和BMDL值</p><p>　　Table 4 DEHP, DBP result in BMD and BMDL values of different endpoints</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　Hershberg

30、er試驗(yàn)通過給青春期雄性大鼠去勢，使大鼠體內(nèi)內(nèi)源性雄激素水平降到最低，減少內(nèi)源性雄激素的個體差異。去勢后的大鼠經(jīng)過7d恢復(fù)后雄激素依賴性器官組織重量達(dá)到一致的基準(zhǔn)水平，此時雄激素依賴性器官組織對雄激素的敏感性更強(qiáng)，當(dāng)靶器官組織受到參照雄激素（TP）刺激后重量的增加會相對一致。Hershberger試驗(yàn)是目前檢測抗雄激素的最有效的篩檢方法[]。本課題組的陽性物FT在Hershberger試驗(yàn)中對大鼠的雄激素依賴性器官產(chǎn)生了明顯的抑制作用，

31、成功建立了檢測模型。</p><p>　　Hershberger試驗(yàn)指出，如果劑量組中兩個或兩個以上的組織器官重量出現(xiàn)顯著減少時，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性，即受試物具有抗雄性作用。本研究發(fā)現(xiàn)DEHP和DBP可顯著影響肛提肌-海綿體肌、尿道球腺、腹側(cè)前列腺重量，說明兩種物質(zhì)表現(xiàn)出抗雄激素作用。其他研究結(jié)果提示了這兩種物質(zhì)抗雄激素作用的潛在機(jī)制，比如：DEHP（500mg/kg.bw）影響青春前期雄性大鼠精子的發(fā)生、分

32、化和成熟，血清T水平較對照降低[]；PAEs導(dǎo)致雄性成年小鼠睪丸重量減輕和生精小管的萎縮，并伴有精原細(xì)胞的凋亡[]；低劑量的DEHP導(dǎo)致大鼠前列腺質(zhì)量減輕，高劑量的DEHP暴露導(dǎo)致睪丸的組織生理學(xué)改變[]。但體外受體結(jié)合試驗(yàn)表明DEHP和DBP不能直接結(jié)合雄激素受體（Androgen Receptor,AR）[],也有研究表明DEHP、DBP是通過雄激素受體非依賴性機(jī)制誘導(dǎo)抗雄激素作用[]。由于Hershberger試驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫鬅o睪丸，

33、下丘腦-垂體-性腺軸無法通過反饋機(jī)制進(jìn)行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，因此推測DEHP和DBP可能通過干擾雄激素轉(zhuǎn)運(yùn)或者改變受體水平進(jìn)而影響組織對雄激素的反應(yīng)能力。</p><p>　　Byung[]研究表明，DEHP的抗雄激素作用強(qiáng)于DBP，本研究也說明了這一點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，DEHP在劑量達(dá)到250mg/kg.bw時，對模型大鼠的腹側(cè)前列腺、肛提肌-海綿體肌、尿道球腺產(chǎn)生顯著抑制作用，并且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系；DBP劑量達(dá)到5

34、00mg/kg.bw時，對模型動物的肛提肌-海綿體肌、尿道球腺產(chǎn)生抑制作用，劑量上升到750mg/kg.bw時，腹側(cè)前列腺和精囊也產(chǎn)生抑制作用。從靶器官敏感度角度來看，肛提肌-海綿體肌、尿道球腺、腹側(cè)前列腺的反應(yīng)較為敏感，精囊次之，陰莖頭反應(yīng)最不敏感。早有研究表明肛提肌-海綿體肌的發(fā)育依賴于睪酮[],前列腺的發(fā)育依賴于雙氫睪酮[]，因此結(jié)合肛提肌-海綿體肌和前列腺兩個靶器官可以用于內(nèi)分泌干擾作用機(jī)制的研究。</p><

35、;p>　　BMD法是目前毒理學(xué)領(lǐng)域確定化學(xué)物毒性參考值的最新方法，較傳統(tǒng)的化學(xué)物未觀察到有害作用劑量水平（no observed effect level, NOAEL）和觀察到有害作用最低水平（lowest observed adverse effect level, LOAEL）更科學(xué)[]。DEHP和DBP分別在250mg/kg.bw、500mg/kg.bw劑量組表現(xiàn)出了抗雄性作用，即DEHP和DBP的抗雄激素作用LOAEL值

36、分別為250和500mg/kg.bw,相應(yīng)的NOAEL值分別為150mg/kg.bw和250mg/kg.bw。結(jié)合表4顯示結(jié)果，可知DEHP和DBP的抗雄激素作用的BMDL10分別為150.38和276.78mg/kg.bw，兩種物質(zhì)的BMDL10通過希爾模型和指數(shù)模型擬合所得。得到的BMDL10在數(shù)值上與NOAEL相近，但BMD法充分利用了所有的劑量-反應(yīng)資料并且通過BMDL10來說明數(shù)據(jù)的變異性及不確定性，因此結(jié)果更加可靠[]。&l

37、t;/p><p>　　另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DEHP劑量為150mg/kg.bw及以上時，大鼠肝臟器系數(shù)顯著高于陰性對照，劑量為500mg/kg.bw及以上時，大鼠腎臟器系數(shù)也顯著高于陰性對照；DBP在劑量為500和750mg/kg.bw時也分別表現(xiàn)為肝和腎臟器系數(shù)增加。在多項研究[-]]中也表述了相似的結(jié)論，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　綜上所述，本研究中DEHP和DBP單