我國(guó)蘋果主產(chǎn)區(qū)潛隱性病毒侵染特征研究.pdf

1、蘋果病毒病是對(duì)果樹(shù)危害最大、影響最廣的一種世界性病害。果樹(shù)感染病毒后,一般樹(shù)體生長(zhǎng)量減少,產(chǎn)量降低,果實(shí)品質(zhì)下降,不耐貯藏,嚴(yán)重時(shí)樹(shù)體生長(zhǎng)急劇衰退至枯死。在尚無(wú)有效的藥劑防治和治療措施情況下,繁殖無(wú)病毒苗木、實(shí)施果園無(wú)毒化栽培是防治蘋果病毒病的最有效措施。國(guó)外諸多發(fā)達(dá)國(guó)家早在20世紀(jì)60年代已經(jīng)開(kāi)始發(fā)展無(wú)病毒化栽培,目前已基本普及。而我國(guó)對(duì)蘋果病毒病研究起步較晚,無(wú)毒化栽培推廣緩慢。『F確認(rèn)識(shí)病毒病的危害,準(zhǔn)確掌握目前蘋果病毒病的發(fā)生情

2、況是制定和推廣無(wú)毒化栽培政策的基礎(chǔ)。近年來(lái)我國(guó)蘋果病毒病的調(diào)查鑒定和研究工作相對(duì)薄弱,一些參考數(shù)據(jù)相對(duì)較老或者不全,因此對(duì)全國(guó)進(jìn)行病毒危害現(xiàn)狀調(diào)查對(duì)推進(jìn)我國(guó)無(wú)毒化栽培有重要意義。本研究以建立高效、簡(jiǎn)化、準(zhǔn)確率高、適合大規(guī)模樣品的檢測(cè)為目標(biāo)對(duì)蘋果病毒的RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,并通過(guò)對(duì)病毒時(shí)空分布規(guī)律的研究篩選最佳檢測(cè)部位和取樣時(shí)間,在此基礎(chǔ)上對(duì)我國(guó)三個(gè)蘋果主產(chǎn)區(qū)的病毒侵染狀況做全面調(diào)查。主要結(jié)果如下:
　　 1.蘋果潛隱性病

3、毒檢測(cè)體系的優(yōu)化
　　 在三種潛隱性病毒的常規(guī)兩步單重RT-PCR檢測(cè)體系基礎(chǔ)上,對(duì)檢測(cè)效率更高的多重RT-PCR檢測(cè)體系進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 (1)對(duì)ASPV的引物進(jìn)行了重新設(shè)計(jì),篩選出了最佳的引物對(duì)組合。
　　 (2)對(duì)兩步多重RT-PCR檢測(cè)體系進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的RT體系中的ESReactionMix和EasyScriptRT/RIEnzymeMix包含了反應(yīng)所需的主要試劑,只需加入適量總RNA即可。使操作

4、步驟簡(jiǎn)化,工作效率提高,而且減少了人為出錯(cuò)和污染的幾率,更加減少了誤差。再者,PCR擴(kuò)增過(guò)程使用含Taq酶的ESMIX,不僅包括了擴(kuò)增過(guò)程所需要的除引物和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物外的所有試劑,而且含溴酚藍(lán)染料。PCR擴(kuò)增完成后,產(chǎn)物直接上樣電泳,節(jié)省了上樣時(shí)間,使得操作步驟簡(jiǎn)化,檢測(cè)效率提高。
　　 (3)優(yōu)化的一步多重RT-PCR檢測(cè)體系使用新型試劑盒,該試劑己將RT和PCR反應(yīng)所需的Buffer、Mg2+、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制

5、劑和Taq酶等按比例配成兩種緩沖液Mix。反應(yīng)體系配制時(shí),只需按說(shuō)明加入適量已含溴酚藍(lán)染料Mix、總RNA模板和引物即可用于反應(yīng),擴(kuò)增完成直接上樣電泳。這比傳統(tǒng)的RT-PCR方法操作步驟更簡(jiǎn)單,大大降低了污染幾率和誤差,同時(shí)節(jié)省了上樣時(shí)間,使得檢測(cè)過(guò)程更省時(shí),工作效率更高。
　　 另外,對(duì)生產(chǎn)上危害較重的蘋果銹果類病毒和蘋果花葉病毒的RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,建立了操作步驟更簡(jiǎn)單、效率更高的RT-PCR檢測(cè)體系。
　

6、　 2.ASPV和ACLSV在樹(shù)體內(nèi)的時(shí)空分布規(guī)律
　　 采用熒光定量RT-PCR技術(shù),對(duì)2010年4月到12月采集的枝條頂端、枝皮組織和根皮組織,用蘋果肌動(dòng)蛋白mRNA序列引物作為內(nèi)參,以4月份枝皮組織的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行相對(duì)表達(dá)差異分析,結(jié)果顯示:
　　 (1)ASPV在枝皮組織中的含量呈先降低再升高再降低的趨勢(shì),即6月份的含量最低,8月份稍有增高,10月份達(dá)到5個(gè)采集時(shí)期的最高值,12月份略有下降,最高含量約是

7、最低含量的5.5倍;ASPV在枝條頂端的含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),即6月份含量最低,8月份略增,10月份繼續(xù)升高,12月份達(dá)最高值,最高含量約是最低含量的3.0倍;ASPV在根皮中的分布規(guī)律為先升高再降低,即4月份含量最低,8月份含量增加,12月份略有下降,最高含量約是最低含量的2.3倍。
　　 (2)ACLSV在樹(shù)體內(nèi)的時(shí)空分布規(guī)律與ASPV基本相似,僅枝條頂端的含量變化略有不同,即ACLSV在10月份的增量小于ASPV,且

8、此時(shí)含量低于12月份。
　　 3.蘋果潛隱性病毒在我國(guó)蘋果主產(chǎn)區(qū)的分布特征
　　 通過(guò)對(duì)我國(guó)8個(gè)蘋果主產(chǎn)省,50個(gè)果園的2144個(gè)樣品分析結(jié)果表明:
　　 (1)采樣果園均不同程度地受到蘋果潛隱性病毒的侵染,果園病毒侵染率達(dá)100％,危害情況較嚴(yán)重。
　　 (2)三種蘋果潛隱性病毒(ASGV、ACLSV、ASPV)的整體發(fā)生率分別為:94.80%、59.33%、64.72%;總體混合侵染率為59.05%。

9、相對(duì)而言,ASGv的侵染率最高,ACLSV的侵染率最低。
　　 (3)三種蘋果潛隱性病毒在不同品種間的侵染也有一定差異。三大主栽品種富士、紅星、嘎拉的病毒侵染率都較高,ASGV的侵染率最高幾乎都為100%;ASPV和ACLSV的侵染率相對(duì)最低。部分品種如金冠、喬納金、秦冠等的病毒侵染率也較高,一些砧木品種和地方品種的染毒情況較低。
　　 (4)在地區(qū)分布上,陜西省和河北省受三種蘋果潛隱性病毒侵染較嚴(yán)重,復(fù)合侵染率也較高;