豬干擾素誘導蛋白BST-2克隆、表達及生物學活性檢測.pdf

1、病毒感染宿主后，依賴于宿主細胞蛋白的輔助因子，才能完成其感染和復制周期；同時宿主細胞迫于病毒感染的壓力，必須進化出各種抵御病毒的方式，病毒和宿主這種相互作用關系，使雙方在選擇壓力下都得到進化。宿主細胞限制因子是先天免疫系統(tǒng)中的組分，具有抗多種病毒的活性，這些限制因子包括干擾素誘導的抗病毒蛋白，如TRIM-5a、APOBEC3G、APOBEC3F和BST-2(也稱為Tetherin或CD317)等。
　　 干擾素(Interfer

2、on，IFN)是1957年，英國病毒生物學家AlickIsaacs和瑞士研究人員JeanLindenmann在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)的。被病毒感染的細胞產(chǎn)生一種能作用于其他細胞并干擾病毒復制的因子，故將其命名為干擾素。干擾素是一組能誘導人及動物細胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學活性抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用真核細胞能夠直接或經(jīng)過誘導來表達一系列蛋白來抵抗病毒的感染。BST-

3、2(tetherin，CD317)是一種可以抑制HIV-1從被感染細胞釋放的細胞因子，它的抗病毒效能是在對HIV-1的附屬蛋白Vpu的研究中發(fā)現(xiàn)的，該因子抑制病毒顆粒釋放的作用是通過蛋白來介導的，并且在此過程中，Ⅰ型干擾素誘導產(chǎn)生的適宜的細胞環(huán)境也是至關重要的。
　　 為了研究BST-2的生物學活性，根據(jù)已發(fā)表的BST-2(Bonemarrowstromalantigen-2)蛋白的cDNA基因序列，設計一對特異性引物，采用反轉(zhuǎn)

4、錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法從豬瘟弱毒疫苗和聚肌胞(PolyI：C)刺激的豬腎細胞(PK-15)中擴增豬BST-2的完整cDNA，并構建到真核表達載體pcDNA3.1/V5-His，構建重組表達質(zhì)粒pcDNA-BST-2，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞表達BST-2蛋白，間接免疫熒光檢測重組BST-2蛋白的表達，純化重組蛋白并經(jīng)Bradford法定量，SDS-PAGE及Westernblot檢測，以純化的蛋白做免疫原免疫小鼠，制備出

5、抗BST-2蛋白的陽性血清。利用BST-2蛋白及抗BST-2重組蛋白陽性血清研究BST-2各種生物學活性。
　　 結果顯示，雙酶切鑒定和核酸序列測定證實pcDNA-BST-2真核表達質(zhì)粒構建成功，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，經(jīng)間接免疫熒光能夠檢測到綠色熒光。生物學活性測定重組BST-2蛋白具有一定的抗水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus，VSV)、H9禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，