稻瘟菌P型ATP酶的基因家族分析及其基因MoCTA1、MoCTA3的研究.pdf

1、稻瘟菌是水稻的主要病原菌之一，是全球主要稻區(qū)最具毀滅性的病原菌，同時(shí)也是植物-真菌互作研究的模式真菌。稻瘟菌致病機(jī)理的研究，可以為制定稻瘟菌的持續(xù)管理策略和抗病品種的培育提供理論基礎(chǔ)。P型ATP酶是一類位于質(zhì)膜上的可以被ATP驅(qū)動(dòng)并發(fā)生磷酸化的陽離子泵，在植物物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞膜穩(wěn)定性等方面具有重要作用。已有的研究表明，稻瘟菌的P-ATPase編碼基因在其附著胞發(fā)育及致病性過程中具有重要作用。本文通過生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)在稻瘟

2、菌中存在有23個(gè)P-ATPase的編碼基因；利用PCR的方法克隆了其中一個(gè)基因MoCTA3，并研究了其表達(dá)情況；通過基因敲除技術(shù)成功獲得了MoCTA1基因的缺失突變體，并對(duì)其表型進(jìn)行了分析。具體研究結(jié)果如下：
　　 1.通過數(shù)據(jù)庫中P-ATPases的氨基酸序列對(duì)稻瘟菌的全基因組表達(dá)(CodingSequence，CDS)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索和分析，共發(fā)現(xiàn)有23個(gè)P-ATPases基因，進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示這23個(gè)基因分屬于4個(gè)家族和7

3、個(gè)亞家族。運(yùn)用MEME程序分析這些P-ATPases蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)有6條基序在90％以上的氨基酸序列中均有出現(xiàn)。對(duì)這些基因的GC含量分析結(jié)果表明，它們的平均GC含量(0.519-0.62)，稍高于稻瘟菌整個(gè)基因組的平均值(0.516)，同時(shí)這些基因內(nèi)各區(qū)段GC含量變化不大，沒有明顯的梯度變化。
　　 2.利用PCR的方法，從稻瘟菌中克隆了一個(gè)P-ATPase基因MoCTA3。對(duì)其進(jìn)行了序列分析和氨基酸序列比對(duì)，并通過qRT-

4、PCR檢測(cè)了該基因在稻瘟菌侵染水稻葉片0h、48h、72h、96h，4個(gè)不同時(shí)期以及菌絲階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明該基因全長3747bp，含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，編碼1096個(gè)氨基酸，含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，第24-98位有一個(gè)保守的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域；與朱紅叢赤殼、尖孢鐮刀菌、蝗綠僵菌、炭疽菌等真菌的P-ATPase氨基酸相似性分別為77％、78％、83％和79％；基因表達(dá)結(jié)果顯示該基因在菌絲階段的表達(dá)量明顯高于侵染階段，侵染過程中隨侵染

5、時(shí)間延長表達(dá)量逐漸升高，72h時(shí)達(dá)到高峰，隨后降低，說明MoCTA3可能參與了稻瘟菌的侵染過程，在稻瘟菌的致病性方面具有重要作用。
　　 3.通過基因敲除的方法得到稻瘟菌P-ATPase基因Mo6CTA1的缺失突變體。表型分析發(fā)現(xiàn)，在CM和PDA培養(yǎng)基上，⊿MoCTA1的氣生菌絲生長致密，但生長速度與野生型相比卻顯著降低，而在產(chǎn)孢板上的氣生菌絲疏松，生長速度無明顯差異。GFP表達(dá)結(jié)果表明，MoCTA1的表達(dá)產(chǎn)物主要集中在孢子的隔