單miRNA介導(dǎo)抗馬鈴薯Y病毒和煙草蝕紋病毒的比較研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)作為植物病毒中最大的屬，有大約200種確定和可能的種類，能侵染茄科、藜科等多種植物，嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯Y病毒(Potato virusY，PVY)和煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)是馬鈴薯Y病毒屬中兩種典型病毒。近年來(lái)，人工合成的microRNA(amicroRNA，amiRNA)的應(yīng)用為植物抗病毒策略提供了新的途徑。amiRNA介導(dǎo)的病毒抗性具有抗

2、病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過(guò)比較PVYN株系和TEV-SD1株系的基因組序列，篩選出高序列相似性并符合miRNA特征的9個(gè)靶位點(diǎn)序列，通過(guò)改造miRNA319a前體，分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草。研究發(fā)現(xiàn)利用單miRNA可獲得多抗病毒轉(zhuǎn)基因植株，但是抗性與相似性并不呈完全正相關(guān)，不同位點(diǎn)堿基錯(cuò)配對(duì)靶序列降解的影響存在差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究amiRNA介導(dǎo)病毒抗性的產(chǎn)生機(jī)制，尋找最佳靶序列，及利

3、用該策略培育多抗病毒轉(zhuǎn)基因植物提供依據(jù)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)通過(guò)PVYN與TEV-SD1序列相似性比對(duì)，參考amiRNA的篩選準(zhǔn)則，選出9個(gè)符合特征的靶序列，分別位于CI、NIa-VPg、NIb、CP基因中。以此設(shè)計(jì)9對(duì)引物，對(duì)pre-miRNA319a前體進(jìn)行改造，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pR-amiR-1、pR-amiR-2、pR-amiR-3、pR-amiR-4、pR-amiR-5、pR-amiR-6、pR-amiR

4、-7、pR-amiR-8和pR-amiR-9。
　　 (2)將構(gòu)建的植物表達(dá)載體利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。瞬時(shí)侵染本生煙，3d后進(jìn)行miRNA的雜交分析，結(jié)果表明構(gòu)建的amiRNA植物表達(dá)載體在植物體內(nèi)能被成功的加工成amiRNA。
　　 (3)將構(gòu)建的植物表達(dá)載體利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。轉(zhuǎn)化植株均生長(zhǎng)正常，與非轉(zhuǎn)化植株無(wú)明顯差異。再生植株經(jīng)PCR檢測(cè)，獲得轉(zhuǎn)pR-amiR-1

5、的煙草44株，轉(zhuǎn)pR-amiR-2的煙草38株，轉(zhuǎn)pR-amiR-3的煙草36株，轉(zhuǎn)pR-amiR-4的煙草32株，轉(zhuǎn)pR-amiR-5的煙草41株，轉(zhuǎn)pR-amiR-6的煙草32株，轉(zhuǎn)pR-amiR-7的煙草38株，轉(zhuǎn)pR-amiR-8的煙草35株，轉(zhuǎn)pR-amiR-9的煙草32株。
　　 (4)T0代植株自交得到的種子置于含卡那霉素(100mg/L)的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，每個(gè)株系隨機(jī)選取若干株于溫室移栽，待T1代轉(zhuǎn)基因煙草

6、長(zhǎng)至4～5葉期時(shí)接種PVYN與TEV-SD1?？共÷式y(tǒng)計(jì)顯示，人工構(gòu)建的pR-amiRs載體能賦予轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)PVYN與TEV-SD1的抗病性，但不同pR-amiRs載體之間抗病性存在差異。
　　 (5)轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析表明，轉(zhuǎn)基因在RNA水平上得到了表達(dá)，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，抗病植株中有大量amiRNA存在，抗性與amiRNA積累量呈正相關(guān)，表明病毒抗性是由amiRNA介

7、導(dǎo)的。5'RLM-RACE驗(yàn)證結(jié)果顯示，amiRNA能準(zhǔn)確的指導(dǎo)mRNA靶序列的剪切。
　　 (6)轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草基因組中至少存在1～4個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因整合。結(jié)合植株抗性分析，發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)與植株抗病性之間沒(méi)有必然聯(lián)系。
　　 (7)分析比較影響amiRNA介導(dǎo)抗性產(chǎn)生的因素發(fā)現(xiàn)，amiRNA與靶序列存在1～4個(gè)錯(cuò)配仍能介導(dǎo)較高抗性；當(dāng)錯(cuò)配數(shù)低于4個(gè)時(shí)，抗性水平與錯(cuò)配個(gè)數(shù)之間無(wú)明顯規(guī)