馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒的實時熒光同步檢測技術的研究.pdf

1、馬鈴薯是世界性高產作物，我國種植面積和產量都居世界第一位。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產中的重要制約因素，嚴重影響其產量和質量，目前還沒有“特效藥”進行防治。實際生產中，脫毒種薯是防治馬鈴薯的主要措施，而這需要快捷、簡便。特異靈敏的檢測技術作為支撐。自PCR技術發(fā)明以來，RT-PCR已經成為病毒檢測的一種普遍采用方法，該技術快速、特異、靈敏的特點，可以滿足國內外現(xiàn)代植物檢疫的要求。由于馬鈴薯病毒病常常為多種病毒復合感染，其中馬鈴薯Y病毒(PV

2、Y)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)是危害最嚴重的病毒，并容易發(fā)生交叉感病。生產實踐迫切需要有能夠同時檢測兩種病毒的快速、靈敏檢測技術。
　　 為此，本研究在設計、篩選對馬鈴薯Y病毒(PVY)和馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)核酸特異性擴增的基礎上，通過比較篩選快捷制樣技術、優(yōu)化檢測程序和檢測條件，建立二重熒光定量RT-PCR檢測體系，用于PVY、PLRV的同步檢測。該方法適用于馬鈴薯脫毒種薯質量檢測和田間植株病害鑒定以及發(fā)病情況監(jiān)控，具

3、有實際應用價值。
　　 研究的主要內容及結果：
　　 ⑴通過比較改進CTAB法、試劑盒法、浸泡法、微濾柱離心法對提取RNA濃度和純度的影響，確定微濾柱離心法作為病害檢測的制樣方法，該方法能有效地排除植物色素、蛋白質、多糖等物質對RT-PCR反應的干擾，制備適合于RT-PCR的馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒的RNA，減少RT-PCR的假陰性發(fā)生率。以RT-PCR獲得的DNA片段經測序驗證后以其為模板，通過體外轉錄獲得大量、高

4、質量RNA作為無害化陽性對照。
　　 ⑵選擇兩種病毒保守核苷酸序列區(qū)域分別設計各自的Taqman探針及其引物。標記多種發(fā)光基團和淬滅基團，分別建立了馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒的單重熒光定量RT-PCR檢測方法，對影響PCR反應的一系列因素進行了優(yōu)化，并建立了標準曲線，能夠在病毒檢測中進行絕對定量，最低能檢測1500個拷貝模板數，在實際檢測運用中取得很好的效果。
　　 ⑶在分別建立兩種病毒實時熒光PCR檢測方法的基礎上，

5、經過引物、探針以及檢測條件的優(yōu)化，建立了馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒雙重RT-PCR檢測體系。經確診樣品檢驗及田間實際樣品檢測驗證，該體系檢測特異性強，僅對PVY喝PLRV能檢出，其他馬鈴薯病毒病及病原菌不能檢出；靈敏度高，對PVY喝PLRV的檢測敏感性均達到1500個模板拷貝數，比常規(guī)RT-PCR敏感性高100倍；抗干擾能力強，不受樣品中兩種病毒含量差異的影響，并且能夠在病毒檢測中進行相對定量，在實際檢測運用中取得很好的效果。