福建馬鈴薯病毒病的快速檢測(cè)技術(shù).pdf

1、馬鈴薯所具有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值位列世界主要作物第四位，在我國(guó)馬鈴薯的總產(chǎn)量以及種植面積均居世界首位。馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)中制約馬鈴薯高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的關(guān)鍵性因素，通過(guò)脫毒技術(shù)生產(chǎn)健康種薯或近乎無(wú)毒的種薯，已經(jīng)成為預(yù)防馬鈴薯病毒病最為成功的手段之一。因此，建立一套快速，高效，穩(wěn)定的馬鈴薯檢測(cè)技術(shù)有利于加速育種進(jìn)程，保證種薯質(zhì)量和調(diào)運(yùn)的安全。本研究的主要目的是研究并建立適合于同時(shí)檢測(cè)四種馬鈴薯病毒的單重、多重RT-PCR分子檢測(cè)體系，并針對(duì)反應(yīng)體系中

2、的引物濃度比例、退火溫度、Mg2+濃度比例等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，以期為研制馬鈴薯病毒病檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)保障。
　　1、RT-PCR特異性引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)已發(fā)表馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯S病毒(PVS)及馬鈴薯M病毒(PVM)四種病毒的外殼蛋白（CP）序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，擴(kuò)增片段大小為379bp（PVY）、514bp（PYA）、656bp（PVS）及881bp（PVM）。
　　2、PCR檢測(cè)

3、體系優(yōu)化：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，適當(dāng)提高退火溫度，有利于四重PCR擴(kuò)增；Mg2+濃度對(duì)單重PCR擴(kuò)增影響不大，但對(duì)四重PCR的擴(kuò)增有著明顯的影響；dNTPs濃度和引物濃度比對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響不大。
　　3、擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性驗(yàn)證：經(jīng)NCBIBLAST比對(duì)，結(jié)果表明PVY、PVA、PVS和PVM四種病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與NCBIBLAST報(bào)道的相應(yīng)病毒的序列同源性分別達(dá)到99%、98%、98%和98%以上，表明四種病毒的RT-PCR擴(kuò)

4、增產(chǎn)物準(zhǔn)確無(wú)誤。
　　4、PCR靈敏度測(cè)定：通過(guò)對(duì)四種病毒cDNA的濃度稀釋?zhuān)瑢?duì)4種病毒在單重PCR檢測(cè)中的最低檢測(cè)濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，在PVY、PVA、PVS和PVM的單重PCR檢測(cè)中各病毒的最低檢測(cè)濃度分別為：0.299ng/?L，2.67ng/?L，0.296ng/?L和0.202ng/?L。
　　5、研究體系的應(yīng)用：采用四重RT-PCR檢測(cè)體系，對(duì)來(lái)自周寧、福州、龍巖及龍海地區(qū)共88個(gè)馬鈴薯種薯樣品檢測(cè)，結(jié)果表明