廣西柑橘裂皮病快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、柑橘裂皮病是一種重要柑橘病害，主要為害以枳或枳的雜種作砧木的柑橘樹；而其它砧木的柑橘植株感染裂皮病類病毒后不表現(xiàn)癥狀。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，嚴(yán)重制約柑橘生產(chǎn)。目前檢測(cè)柑橘裂皮病的方法有指示植物、聚丙烯酰胺凝膠電泳和分子檢測(cè)，其中RT-PCR是一種快速檢測(cè)柑橘裂皮病的方法，但廣西尚未有開展這方面研究與應(yīng)用的報(bào)道。目前，廣西柑橘無(wú)病毒苗木生產(chǎn)過(guò)程中，側(cè)重培育脫除柑桔黃龍病的無(wú)病毒苗木，并未重視裂皮病的脫除與檢測(cè)，因而對(duì)廣西現(xiàn)有的無(wú)黃龍病

2、苗木是否帶有柑橘裂皮病的情況尚不清楚。為了快速檢測(cè)田間柑桔植株、引進(jìn)的柑桔品種和苗木感染裂皮病情況，需要建立一套快速檢測(cè)方法，為此開展了本研究，其主要結(jié)果如下：
　　 1、比較分析了Trizol法、改良Bugous法、改良異硫氰酸胍法這三種柑桔總RNA提取方法，結(jié)果表明：三種方法中Trizol法步驟最簡(jiǎn)單，耗時(shí)最短，但提取總RNA純度不高，改良Bugous法提取的總RNA純度、含量最高，雖耗時(shí)較Trizol法與改良異硫氰酸胍法較

3、長(zhǎng)，但綜合考慮，改良Bugous法為最優(yōu)方法。適于大量樣品高質(zhì)量RNA的快速提取。
　　 2、進(jìn)行了RT-PCR優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，從引物、引物濃度、dNTP濃度、退火溫度等方面對(duì)RT-PCR進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的RT-PCR能非常穩(wěn)定地檢測(cè)出陽(yáng)性對(duì)照中的CEVd，靈敏度高、特異性強(qiáng)，適合對(duì)大量田間樣品的快速檢測(cè)。
　　 3、對(duì)同一種感病的寄主材料的三個(gè)不同方位的成熟葉與嫩葉取樣檢測(cè)，都可以檢測(cè)到CEVd，說(shuō)明CEVd的快速檢測(cè)不受取

4、樣部位的限制。運(yùn)用RT-PCR對(duì)寬皮柑橘類、橙類、柚類、枸櫞類等30多個(gè)柑桔品種（宮川、山川、市文、79-2椏柑、貢柑、普益臍橙、夢(mèng)臍橙、墨科特臍橙、紅肉夏橙、得爾塔夏橙、HB柚、琯溪蜜柚、星路比、藜檬、蕉柑、右江椪柑、夏椪柑、馬水桔、宮本、山下紅、日南一號(hào)、興津、茂谷柑、暗柳橙、蕉柑、右江椏柑、野生柚子、越南檸檬、越南橙子、越南柚、南瑞白柚）的田間樣品柑桔進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)種類都能檢測(cè)到CEVd，說(shuō)明RT-PCR適合于不同柑桔品種田間大量

5、樣品的檢測(cè)。
　　 4、對(duì)廣西栽培品種、越南品種、中越邊境樣品、無(wú)黃龍病苗木以及無(wú)黃龍病接穗的裂皮病快速檢測(cè)表明：6個(gè)供試的廣西柑桔栽培品種中有4個(gè)帶病。14個(gè)越南品種中有8個(gè)帶病。中越邊境4個(gè)野生柚子品種中有1個(gè)帶病。宮川、宮本、市文、山下紅、日南一號(hào)、山川、興津7個(gè)品種，每個(gè)品種檢測(cè)無(wú)黃龍病苗木9-10株，結(jié)果每個(gè)品種有1-7株被檢測(cè)出帶有CEVd。從廣西某研究單位采集33個(gè)品種的無(wú)黃龍病接穗嫁接在網(wǎng)室的實(shí)生枳殼苗上，采樣進(jìn)