梅EST分析與利用及梅、杏合子前生殖隔離的初步證據(jù).pdf

1、梅（Prunus mume）是薔薇科(Rosaceae)李屬，原產(chǎn)中國，在東亞國家有著廣泛的種植。梅在我國已有7000年以上的應(yīng)用歷史，栽培歷史也有3000多年。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，從基因水平上認(rèn)識(shí)梅的生長發(fā)育以及開展梅在核果類植物中的遺傳進(jìn)化研究逐漸得到了重視。近年來分子標(biāo)記在植物分類和親緣關(guān)系分析等方面得到了廣泛的應(yīng)用。我國擁有豐富的梅種質(zhì)資源，對(duì)梅資源進(jìn)行分類和親緣關(guān)系的研究，有利于梅種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定、創(chuàng)新和合理利用

2、。本研究以梅品種‘細(xì)葉青’為材料，構(gòu)建了梅花和果實(shí)的cDNA文庫;結(jié)合文庫所得的EST序列以及其他核果類植物中的已知功能的部分EST序列，首次通過芯片雜交試驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行梅和杏果實(shí)發(fā)育過程中差異基因表達(dá)的分析。另外，本研究還對(duì)梅、杏之間的隔離機(jī)制進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下:
　　 1.以梅品種‘細(xì)葉青’不同時(shí)期的花和果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用Creator SMARTcDNA Construction Kit，構(gòu)建了我國果梅第

3、一個(gè)花和果實(shí)的cDNA文庫。結(jié)果表明，該文庫的庫容量約為1.4×106 pfu/mL，從擴(kuò)增文庫中隨機(jī)挑取30個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，其重組率達(dá)97％,插入片段多分布在1～3 kb之間，平均大于1kb，說明本研究成功構(gòu)建了果梅花和果實(shí)的cDNA文庫，為進(jìn)一步開展果梅開花調(diào)控和果實(shí)發(fā)育等相關(guān)基因的克隆及其表達(dá)與功能分析等研究奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 2.構(gòu)建了一個(gè)梅花和果實(shí)的cDNA文庫，共測序10123個(gè)克隆，去冗余后得到高質(zhì)量的E

4、ST序列8，656條。經(jīng)拼接獲得組4473 unigenes，包括1492個(gè)contigs和2981個(gè)singletons，并提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(IDS: GW868575-GW873047)。經(jīng)BLASTx后，有1294個(gè)unigene具有已知或假定功能。
　　 3.利用MISA軟件對(duì)10，123條梅EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找，得到含SSR位點(diǎn)的序列935條，SSR位點(diǎn)1，233個(gè)，平均每100條EST序列中含有12.18

5、個(gè)SSR位點(diǎn)。2核苷酸、3核苷酸重復(fù)是最主要的重復(fù)類型，分別占35.52％和41.36％。設(shè)計(jì)了42對(duì)EST-SSR引物并進(jìn)行擴(kuò)增，有24對(duì)引物能擴(kuò)增出理想的PCR產(chǎn)物，其中17對(duì)引物具有較好的擴(kuò)增多態(tài)性。測序后發(fā)現(xiàn)14對(duì)引物中有73.08％的片段具有相應(yīng)的SSR位點(diǎn)。利用上述14對(duì)EST-SSR引物，在桃、杏和李上進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)換研究，并對(duì)桃、杏、李、梅進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100％的引物在杏DNA中都能擴(kuò)增出目的片段，多態(tài)性

6、達(dá)87％;89％的引物在桃和李中都能擴(kuò)增出目的片段，在李中的多態(tài)性達(dá)65％，而桃中則為46％。說明梅的EST-SSR引物在其它三種核果類樹種中有很高的通用性。
　　 4.以兩個(gè)梅品種（‘細(xì)葉青’、‘軟條紅梅’）和兩個(gè)杏品種（‘瑪瑙’、‘真魁’）為試驗(yàn)材料，利用李屬核果類植物的10，641條EST序列作為探針，首次通過芯片雜交試驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行梅和杏果實(shí)發(fā)育過程中差異基因表達(dá)的分析。結(jié)果顯示共檢測到2倍以上差異表達(dá)基因1，41

7、8個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因707個(gè)，下調(diào)基因711個(gè)。GO注釋結(jié)果表明，差異表達(dá)基因中，54％(766)具有功能注釋的差異表達(dá)基因主要與代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)育、多細(xì)胞生物過程、定位、生物調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等17個(gè)生物過程;Pathway分析結(jié)果則表明，梅、杏差異表達(dá)基因主要參與糖異生/糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等多個(gè)碳水化合物代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成包括苯丙烷類，黃酮類，類胡蘿卜素，激素和木質(zhì)素的生物合成。隨機(jī)選

8、擇的16個(gè)差異表達(dá)基因（8個(gè)下調(diào)表達(dá)，8個(gè)上調(diào)表達(dá)）熒光定量驗(yàn)證結(jié)果顯示，12個(gè)基因的表達(dá)分析結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本一致，但在不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中有不同強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　 5.利用已獲得的梅Unigene與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的杏、桃EST序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源序列592條，同源序列的總長度為235，576 bp，平均長度和同源性分別為437bp，97.5％;進(jìn)行Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，所有同源序列中有340個(gè)具有

9、相應(yīng)的功能注釋，183個(gè)為未知功能蛋白，其余69個(gè)為沒有相應(yīng)序列信息的新基因;在所有同源序列中共發(fā)現(xiàn)8，818個(gè)SNPs，總頻率為26 bp/SNP。同時(shí)，對(duì)三個(gè)物種的同源序列進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，SNP數(shù)量明顯少于這三者比較的結(jié)果。另外，利用上述所有SNP數(shù)據(jù)信息對(duì)梅、杏、桃3個(gè)物種的聚類分析結(jié)果說明梅、杏的親緣關(guān)系較近，二者與桃親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 6.以68個(gè)梅品種（花梅36個(gè)、果梅32個(gè)）為材料，利用SNPs標(biāo)記對(duì)梅品種的遺

10、傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。以每個(gè)品種的DNA為模板，利用9對(duì)引物擴(kuò)增獲得了總長度均為2，916bp的基因組序列，獲得多態(tài)性SNP位點(diǎn)92個(gè)，分布密度為1SNP/32bp，包括:51個(gè)轉(zhuǎn)換(55.4％)，34個(gè)顛換(37％)，4個(gè)缺失或插入(4.4％)，3個(gè)其它類型(3.3％)。本研究對(duì)花梅和果梅的SNP進(jìn)行了統(tǒng)計(jì):花梅SNP總數(shù)為50，密度為1 SNP/58bp;而果梅中總數(shù)為72，密度為1SNP/41bp，果梅SNP的出現(xiàn)頻率高于

11、花梅，說明果梅品種間的遺傳差異較大，也可能是由于這些花梅品種的育種親本相似或者地理起源相近。根據(jù)92個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性資料，應(yīng)用PHYLIP程序中的鄰位相連法構(gòu)建了花梅和果梅的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明:所有梅品種并沒有形成花梅和果梅兩大組群，說明果梅與花梅在遺傳上具有很高的相似性，是同一樹種中某些性狀（主要是花器官）存在一定差異的不同品種類型。上述系統(tǒng)進(jìn)化樹將供試68份品種資源分成11個(gè)群體，包括5個(gè)花梅組群，2個(gè)果梅組群，4個(gè)花果混合群

12、。至于果梅或花梅小組群的存在，可能由于這些小組群中的品種來源的相似性而具有較近的親緣關(guān)系。本研究結(jié)果表明，盡管花梅和果梅的用途以及花性狀上的明顯差異，但它們在梅的進(jìn)化來源以及遺傳分析方面具有同等的重要性。
　　 7.對(duì)梅、杏之間潛在的生殖隔離因素包括開花物候期和地理分布進(jìn)行了調(diào)查分析。結(jié)果顯示，地理隔離和開花物候隔離是梅、杏保持兩個(gè)物種的界限的關(guān)鍵合子前隔離因素。同時(shí)，我們也提供了杏和梅之間存在合子前隔離的分子證據(jù)。說明杏和梅是