雞黑素皮質(zhì)素受體4基因的分子克隆及其突變體的藥理學(xué)特性初步研究.pdf

1、黑素皮質(zhì)素受體4(melanocortin-4 receptor，MC4R)是一個調(diào)節(jié)能量動態(tài)平衡的重要信號分子，具有介導(dǎo)瘦蛋白(Leptin)的功能，在動物的攝食和能量平衡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其主要作用是控制食欲、體重、能量代謝，已知MC4R基因的突變與豬、鼠和人等的食欲、肥胖、生長等性狀有關(guān)，而雞MC4R基因的功能卻知之甚少。
　　為揭示MC4R在雞的生長及能量調(diào)控中所起的作用，本研究通過對雞MC4R基因進(jìn)行分子克隆及真核表達(dá)

2、載體的構(gòu)建，獲得cMC4R-myc-pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒后，對雞的MC4R基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后將帶有野生型和突變型cMC4Rs基因的質(zhì)粒以磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定野生型和突變型cMC4Rs的總受體蛋白和細(xì)胞表面受體蛋白的表達(dá)水平，同時進(jìn)行競爭性配體結(jié)合試驗(yàn)，研究野生型和突變型cMC4Rs與不同配體的結(jié)合能力。主要研究結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)NCBI公布的雞MC4R基因編碼序列設(shè)計1對特異性引

3、物，由雞的基因組DNA擴(kuò)增雞MC4R基因編碼區(qū)，克隆得到的雞MC4R基因編碼區(qū)為996bp，編碼332個氨基酸。將雞MC4R基因片段以T4DNA連接酶連接于真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)獲得重組質(zhì)粒cMC4R-myc-pcDNA3.1(+)。
　　2、設(shè)計包含突變位點(diǎn)的正、反向引物，選擇Stratagene公司的QuikChange Site-directedMutagenesis試劑盒以重組質(zhì)粒cMC4R-myc-pcDNA

4、3.1(+)為模板進(jìn)行單點(diǎn)突變獲得4個突變型cMC4Rs，分別為G21R、S76L、L299P和Q18H。
　　3、將帶有野生型和突變型cMC4Rs基因的質(zhì)粒以磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，用抗myc單克隆抗體和Alexa Fluor488標(biāo)記的羊抗小鼠IgG對穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，流式細(xì)胞儀測定表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在總表達(dá)水平上，4個突變體中只有cMC4RG21R顯著降低(P＜0.05)，但其細(xì)胞表面表達(dá)水平與c

5、MC4R WT差異不顯著;其他3個突變體cMC4R S76L、eMC4R L299P和cMC4R Q18H的細(xì)胞表面表達(dá)量和總表達(dá)量與cMC4R WT差異均不顯著，表明這3個突變體與cMC4R WT相比表達(dá)水平正常。
　　4、用穩(wěn)定表達(dá)野生型和突變型cMC4Rs的細(xì)胞進(jìn)行競爭性配體結(jié)合試驗(yàn)，分別用內(nèi)源性配體α-MSH和β-MSH以及α-MSH的高效類似物NDP-MSH競爭125I-NDP-MSH與受體結(jié)合，結(jié)果顯示，在配體結(jié)合能力