鹽和低氧脅迫下發(fā)芽大豆γ-氨基丁酸富集與調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、大豆(Glycine max(L.) Merr.)在我國已有2000多年的栽培與食用歷史。大豆富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)。大豆種子發(fā)芽過程中發(fā)生一系列生理生化變化，酶源被激活，酶得以形成，蛋白、碳水化合物等貯藏物質(zhì)被分解成芽體可利用小分子物質(zhì)?？刂拼蠖拱l(fā)芽條件，可富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等大豆中原來含量低或不具有的功能成分。植物中GABA主要由GABA支路和多胺降解途徑合成，其中谷

2、氨酸脫羧酶(GAD，EC4.1.1.15)和二胺氧化酶(DAO，EC1.4.3.6)分別是這兩條途徑中合成GABA的限速酶。植物在鹽和低氧等脅迫條件下能夠強(qiáng)烈激發(fā)GAD和DAO活力，導(dǎo)致植物中GABA的顯著積累。
　　 本文研究了大豆發(fā)芽期間貯藏物質(zhì)的動員和GABA的動態(tài)變化;采用鹽和低氧脅迫研究大豆發(fā)芽過程中GABA的富集與調(diào)控機(jī)理，并對鹽脅迫、低氧脅迫及其聯(lián)合對發(fā)芽大豆富集GABA及發(fā)芽大豆不同部位中GAD、DAO及CaM基

3、因表達(dá)水平的差異，ABA對發(fā)芽大豆GABA富集及調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、大豆種子在30℃浸泡4h，可使大豆種子充分吸水，發(fā)芽率高，并有利于GABA的富集。隨著培養(yǎng)溫度的升高和時間的延長，發(fā)芽大豆生長加快，呼吸作用增強(qiáng)，可溶性糖含量下降，還原糖、可溶性蛋白、游離氨基酸和GABA含量升高，干物質(zhì)含量隨發(fā)芽時間的延長呈下降趨勢。相關(guān)性分析表明，GABA富集量與芽長、呼吸強(qiáng)度、可溶性蛋白和游離氨基酸具有極顯著的

4、正相關(guān)(r，0.878～0.943)。綜合考慮發(fā)芽大豆品質(zhì)和GABA累積量等因素，大豆在30℃黑暗條件下發(fā)芽5d，是生產(chǎn)富含GABA發(fā)芽大豆的適宜條件。大豆發(fā)芽過程中子葉和胚中GAD和DAO活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。發(fā)芽3d后，子葉和胚中的GAD活力達(dá)到最大值。子葉和胚中DAO的活力分別在發(fā)芽5d和4d達(dá)到最大值。
　　 2、應(yīng)用響應(yīng)面試驗研究了NaCl濃度、培養(yǎng)時間和溫度對大豆發(fā)芽富集GABA的影響，擬合出發(fā)芽大豆GABA

5、富集與鹽脅迫培養(yǎng)條件之間的回歸模型。最優(yōu)條件是:NaCl濃度133.5 mM、培養(yǎng)時間5.5 d、培養(yǎng)溫度為33.3℃，在此條件實測GABA富集量為1.197 mg/g DW。方差分析和驗證試驗顯示，模型可準(zhǔn)確的預(yù)測鹽脅迫下大豆發(fā)芽過程中GABA的富集量。最佳通氧處理時機(jī)（正常發(fā)芽和脅迫處理時間組合）研究表明:優(yōu)化的脅迫方式是在30℃用去離子水于黑暗條件下培養(yǎng)2d后通氣脅迫處理2d。在優(yōu)化的低氧脅迫時機(jī)下進(jìn)行大豆發(fā)芽，其生理生化指標(biāo)發(fā)生

6、顯著變化，GABA含量為脅迫前的4.5倍、原料的13.5倍。相關(guān)性分析表明GABA含量和其它生理生化指標(biāo)間相關(guān)性極顯著。通過響應(yīng)面分析得到低氧脅迫下發(fā)芽大豆富集GABA的最優(yōu)條件:培養(yǎng)溫度30.5℃、培養(yǎng)液pH4.13、通氣量0.91 L/min，此條件下GABA富集量為2.65 mg/gDW，是原料的16.6倍。
　　 3、2.5mM的AG處理對發(fā)芽大豆芽長和GAD活力無影響，但DAO活力受到極顯著抑制;低氧脅迫導(dǎo)致大豆胚中G

7、ABA富集量有32％來自DAO活力升高而促進(jìn)的多胺降解途徑。低氧脅迫下，不同濃度的谷氨酸、磷酸吡哆醛、精氨酸、CuCl2，NaCl和CaCl2對發(fā)芽大豆中GABA的積累及GAD和DAO活力有顯著影響，各自的GABA富集量分別為4.07，3.02，3.50，3.26，4.00和3.30 mg/g DW，均顯著高于正常發(fā)芽(CK)和低氧脅迫處理(CK0)。大豆子葉和胚中GAD和DAO有不同的活性分布，胚中的酶活力高于子葉。在低氧脅迫下，Gl

8、u和NaCl對發(fā)芽大豆中GABA富集影響最大，可達(dá)到4.07和4.00 mg/g DW。
　　 4、低氧聯(lián)合鹽脅迫下，大豆子葉和胚中GAD活力是單純低氧脅迫的1.64和1.76倍。在此基礎(chǔ)上添加CaCl2，則GAD活力是單純低氧脅迫的1.80和2.26倍， Glu含量分別比單純低氧脅迫下降低了44.50％和44.37％，說明Ca2+對GAD活力具有明顯的激活作用。低氧聯(lián)合鹽脅迫加入EGTA后，發(fā)芽大豆中Ca2+被螯合，阻斷了Ca

9、2+與CaM的結(jié)合，使GAD活力降低，導(dǎo)致發(fā)芽大豆胚中Glu積累。與低氧聯(lián)合鹽脅迫相比，子葉和胚中Glu含量分別提高了18.32％和35.49％。
　　 5、在低氧聯(lián)合鹽脅迫下，發(fā)芽大豆子葉和胚中DAO活力比單純的低氧脅迫提高了36.52％和28.43％，而fPut含量分別比低氧脅迫下降7.15％和37.98％，說明低氧聯(lián)合鹽脅迫促進(jìn)了腐胺向GABA的轉(zhuǎn)化。低氧聯(lián)合鹽脅迫加CaCl2處理后，發(fā)芽大豆子葉和胚中的fPut含量和GA

10、D活力升高。Ca2+提高了GAD活力，使通過GABA支路轉(zhuǎn)化的GABA量提高，作為一種調(diào)節(jié)，多胺降解途徑間接受到抑制，從而使發(fā)芽大豆子葉和胚中的fPut得到積累。
　　 6、低氧聯(lián)合鹽脅迫下，GABA的兩條富集途徑均被加強(qiáng)，發(fā)芽大豆子葉和胚中GABA含量是單純低氧脅迫的1.47和2.00倍，低氧和鹽脅迫對GABA的富集具有累加效應(yīng)。低氧聯(lián)合鹽脅迫下添加AG，發(fā)芽大豆子葉和胚中GAD基因表達(dá)量分別增加了53.76％和173％，同時

11、CaM表達(dá)也發(fā)生了相應(yīng)的變化，說明DAO活力受到抑制時，多胺降解途徑受阻，誘導(dǎo)了GAD基因強(qiáng)烈表達(dá)，進(jìn)而補(bǔ)充DAO活力抑制后造成的GABA下降量。低氧聯(lián)合鹽脅迫下胚中5條CaM基因表達(dá)均比單純低氧脅迫高，表明低氧聯(lián)合鹽脅迫促進(jìn)了CaM基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了GAD活力，二者共同引起發(fā)芽大豆GABA的富集。低氧聯(lián)合鹽脅迫添加Ca2+后，子葉和胚中GAD基因表達(dá)量分別比未添加組增加0.54和2.98倍，低氧聯(lián)合鹽脅迫處理下，Ca2+通過與Ca

12、M結(jié)合，形成鈣調(diào)素，促進(jìn)發(fā)芽大豆GAD基因表達(dá)，增加了發(fā)芽大豆GABA的富集量。
　　 7、低氧聯(lián)合鹽脅迫下，從子葉(Coty)到芽尖(RadⅡ)GAD活力逐漸升高，其中芽尖部分活力是子葉的3.69倍。外源ABA處理使發(fā)芽大豆內(nèi)源ABA和Ca2+含量升高，SCaM1和SCaM2表達(dá)增加，顯著提高了GAD活力，而Glu含量顯著降低。Flu則使內(nèi)源ABA和Ca2+含量和GAD活力顯著降低，并引起Glu的積累。表明發(fā)芽大豆內(nèi)Ca2+濃

13、度受ABA刺激后迅速提高，并使相應(yīng)的CaM表達(dá)增強(qiáng)，從而激活了GAD活力，更多的Glu轉(zhuǎn)化為GABA，引起發(fā)芽大豆內(nèi)Glu的消耗。與對照相比，ABA處理下發(fā)芽大豆GAD活力提高，而基因表達(dá)水平無顯著差異，而Flu處理降低了GAD活力，卻提高了GAD基因的表達(dá)。表明在低氧聯(lián)合鹽脅迫下，GAD mRNA的表達(dá)并不是富集GABA的唯一因素，GAD蛋白的激活可能起主要作用。
　　 8、RadⅠ部分的DAO活力是發(fā)芽大豆活力最高的部分，R

14、adⅡ的DAO活力下降，但仍顯著高于子葉。在低氧聯(lián)合鹽脅迫下加入ABA后，發(fā)芽大豆從子葉到芽尖5部位的fPut和fSpd均比對照增加。發(fā)芽大豆胚中DAO基因的表達(dá)極顯著高于子葉。ABA處理顯著提高DAO活力，促進(jìn)發(fā)芽大豆fPut和fSpd的積累。加入Flu后二者含量下降，表明ABA可促進(jìn)發(fā)芽大豆fPut和fSpd的積累。DAO活力增強(qiáng)，多胺積累，二者的聯(lián)合作用加快了Put向GABA轉(zhuǎn)化，GABA得以富集。低氧聯(lián)合鹽脅迫下加入ABA后，R