馬鈴薯甲蟲抗藥性分子檢測(cè)及潛在治理措施的發(fā)掘.pdf

1、馬鈴薯甲蟲[Leptinotarsa decemlineata(Say)]，屬鞘翅目，葉甲科，是國(guó)際公認(rèn)的毀滅性檢疫害蟲，也是我國(guó)對(duì)外重大檢疫對(duì)象和重要外來入侵物種之一。馬鈴薯甲蟲于上世紀(jì)90年代從哈薩克斯坦入侵中國(guó)，現(xiàn)分布于新疆維吾爾自治區(qū)北疆的大部分縣（市）。
　　 馬鈴薯甲蟲在新疆北疆嚴(yán)重為害馬鈴薯和茄子?；瘜W(xué)防治是一種經(jīng)濟(jì)、高效的治理措施，但馬鈴薯甲蟲極易對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性。因此，監(jiān)測(cè)其抗藥性及研究其抗性機(jī)制十分重要和

2、迫切。
　　 一、馬鈴薯甲蟲抗藥性的分子檢測(cè)
　　 馬鈴薯甲蟲乙酰膽堿酯酶AChE S291G突變和鈉離子通道LdVssc(l) L1014F突變分別導(dǎo)致對(duì)氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯的抗藥性。采用改進(jìn)的Bi-PASA技術(shù)，于2010年分別檢測(cè)了新疆特克斯縣、察布查爾縣、昌吉市、烏魯木齊市和奇臺(tái)縣馬鈴薯甲蟲田間種群AChE S291G抗性突變，抗性純合子(RR)和雜合子(RW)分別是17.6％和14.7％、50.6％和42.2

3、％、49.9％和41.7％、51.3％和41.4％、以及44.8％和47.4％。檢測(cè)了LdVssc(l)L1014F抗性突變，抗性純合子(RR)和雜合子(RW）分別是5.8％和8.7％、36.1％和27.0％、41.8％和24.8％、12.2％和9.7％、以及7.9％和10.6％。用RT-PCR檢測(cè)了察布查爾縣、昌吉市、烏魯木齊市和奇臺(tái)縣馬鈴薯甲蟲田間種群共18頭，未發(fā)現(xiàn)突變I392T，但是大多數(shù)馬鈴薯甲蟲有突變S291G。這些數(shù)據(jù)顯示

4、，具有抗性突變純合子MM的個(gè)體概率很高，含敏感純合子WW的個(gè)體概率很低。
　　 二、不同靶標(biāo)農(nóng)藥及其復(fù)配劑對(duì)馬鈴薯甲蟲的毒力
　　 通過浸液法測(cè)定特克斯馬鈴薯甲蟲2齡、3齡、4齡幼蟲和成蟲對(duì)硫丹的胃毒毒力。2齡的馬鈴薯甲蟲對(duì)硫丹的胃毒毒力最大，3齡、4齡依次減小，成蟲的最小。在LD50值水平，硫丹的相對(duì)毒力指數(shù)依次是698.4、247.7、11.4和1.0;在LD90值水平，硫丹的相對(duì)毒力指數(shù)依次是546.8、212.7

5、、10.1和1.0。運(yùn)用點(diǎn)滴法測(cè)定各農(nóng)藥不同比例混合物對(duì)馬鈴薯甲蟲成蟲的觸殺毒力。硫丹和辛硫磷以1∶24混合，CI顯著小于1，表現(xiàn)為增效作用。硫丹和水胺硫磷以1∶72和1∶288比例混合，CI顯著小于1，表現(xiàn)為增效作用。
　　 三、馬鈴薯甲蟲細(xì)胞色素P450單加氧酶分子克隆及組織表達(dá)
　　 馬鈴薯甲蟲轉(zhuǎn)錄組中，細(xì)胞色素P450超家族現(xiàn)已驗(yàn)證的基因片段共38條，并由P450國(guó)際委員會(huì)Nelson博士命名。為了全面分析馬鈴薯

6、甲蟲P450基因，我們綜合了NCBI已有序列以及本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲中CYP450屬于人類對(duì)應(yīng)基因的CYP2、CYP3、CYP4和線粒體CYP450群，共93個(gè)。其中CYP2群具有CYP18、CYP305、CYP306和CYP307家族基因各1個(gè)。CYP4群中包括CYP4家族、CYP350家族、CYP412家族和CYP413家族基因分別為20、3、2和1個(gè)。CYP3群中包括CYP6家族基因23個(gè)，CYP9家族基因17個(gè)，CY

7、P345家族基因7個(gè)，CYP347家族基因1個(gè)。線粒體CYP450群中，CYP12、CYP49、 CYP301、CYP302、 CYP314、CYP315、CYP334和CYP353分別有7、1、2、1、1、1、1、1個(gè)。還發(fā)現(xiàn)三個(gè)未知的新基因CYP412a1、CYP412a2和CYP413a1。利用RACE技術(shù)獲得與蛻皮激素代謝相關(guān)CYP18a1、CYP306a1、CYP307a1、CYP302a1、CYP314a1和CYP315a1

8、基因的全長(zhǎng)。
　　 四、馬鈴薯甲蟲持家基因篩選及干擾蛻皮激素代謝相關(guān)P450基因產(chǎn)生的效應(yīng)分析
　　 本章首先篩選了相對(duì)熒光定量PCR的2個(gè)內(nèi)參基因ARF1和RP18。接著運(yùn)用喂食表達(dá)dsRNA的大腸桿菌的方法，干擾馬鈴薯甲蟲6個(gè)編碼蛻皮激素代謝相關(guān)CYP18a1、CYP306a1、CYP307a1、CYP302a1、CYP314a1和CYP315a1的Cyp基因。Qpcr證實(shí)RNAi后，對(duì)應(yīng)靶基因相對(duì)表達(dá)量均有明顯的下