克服水稻Xa32基因抗性的黃單胞桿菌Tn5-突變體的篩選及無(wú)毒基因鑒定.pdf

1、水稻白葉枯病是世界水稻生產(chǎn)中最重要的細(xì)菌性病害之一,白葉枯病細(xì)菌.水稻的互作是研究病原菌-植物互作的模式系統(tǒng)。寄主粳稻日本晴、秈稻9311以及白葉枯病原菌株。PX099、KACC、MAFF基因組測(cè)序已經(jīng)完成,使水稻白葉枯病成為一個(gè)寄主和病原菌基因組都已經(jīng)測(cè)序的重要農(nóng)作物病害,為深入探究病原菌與寄主的分子互作提供了重要的生物信息基礎(chǔ)。
　　 無(wú)毒基因作為與寄主互作的重要因子,決定著病原菌與寄主互作時(shí)的親和反應(yīng)與非親和反應(yīng):在含有相

2、應(yīng)的抗病基因植株上表現(xiàn)為非親和反應(yīng),而在感病植株中表現(xiàn)為親和反應(yīng)。研究植物抗病基因?qū)?yīng)的無(wú)毒基因,有利于揭示病原菌與寄主分子互作的細(xì)節(jié),闡明寄主的抗病分子機(jī)制,對(duì)水稻抗病育種具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)掘的Xa32是一個(gè)來(lái)源于野生稻的抗病譜廣、顯性、全生育期抗性的抗白葉枯病基因。本研究篩選Xa32對(duì)應(yīng)的自葉枯病菌無(wú)毒基因突變體,對(duì)于研究Xa32基因的抗病機(jī)制具有重要的意義。目前為止克隆得到的白葉枯病菌無(wú)毒基因均為TAL

3、effector家族基因,因此,獲得PX099中 TAL effector基因的相鄰基因并對(duì)其功能進(jìn)行整理和預(yù)測(cè),有利于了解 TAL effector在PX099中的分布,并結(jié)合側(cè)翼序列分析的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　 為獲得avrXa32,本研究對(duì)PX099的Tn5-突變體庫(kù)進(jìn)行了大規(guī)模的接種篩選,對(duì)突變體菌進(jìn)行了分子鑒定,分離了突變體插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,獲得的結(jié)果如下:
　　 1.利用人工剪葉接種法,

4、在水稻導(dǎo)入系C4064(含有Xa32)上,大規(guī)模接種PX099的Tn5-突變體庫(kù),篩選使C4064致病的突變體菌株。初篩中,每個(gè)菌株接種1個(gè)植株,獲得了122個(gè)候選致病突變體菌株；復(fù)篩中,每個(gè)菌株接種C4064植株2株,并以感病品種JG30做對(duì)照,最終確認(rèn)6個(gè)能夠克服Xa32抗性的致病突變體菌,編號(hào)為KXM2、KXM12、KXM22、KXM24、KXM66和KXM71。
　　 2.對(duì)獲得的突變體菌,進(jìn)行了分子檢測(cè)。利用PCR的方

5、法檢測(cè)了初篩獲得的122個(gè)使C4064感病的候選突變體菌株,以野生型菌PX099為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)突變體中均能擴(kuò)增出Tn5的目的條帶,表明致病突變體是由Tn5插入引起的。利用Southern雜交的方法檢測(cè)了復(fù)篩確認(rèn)的6個(gè)突變體菌的Tn5拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn)只有KXM22為雙拷貝插入,其余均為單拷貝插入。
　　 3.利用PCR.Walking的方法分離并獲得了其中4個(gè)突變體菌Tn5插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。利用生物信息學(xué)的辦法對(duì)插入位點(diǎn)突變的基因進(jìn)行

6、分析。通過(guò)與NCBI比對(duì),獲得了4個(gè)突變體菌株插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的比對(duì)信息,KXM2、KXM12、KXM22、KXM71插入位點(diǎn)分別編碼ISX006transposase,Na+symporter,ISX08 Transposase和乙酰胞壁酸脫氫酶與腺苷酸激酶之間序列。
　　 4.通過(guò)基因組信息獲得了PX099中各 TAL effector基因座相鄰的基因及功能,發(fā)現(xiàn)TALeffector基因座的兩邊存在顯著的遺傳學(xué)特征,如插入