與小麥抗白粉病相關(guān)的Hv-S-TPK基因的物理定位及其轉(zhuǎn)基因小麥植株的FISH鑒定.pdf

1、小麥白粉?。˙lumeriagraminisf.sp.tritici）是世界上許多國(guó)家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴(yán)重的病害之一，鑒別新的抗白粉病基因并進(jìn)行基因定位和克隆變得越來(lái)越重要。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所利用染色體工程技術(shù)獲得小麥-簇毛麥6V附加系、代換系，6VS/6AL易位系等遺傳材料，并將Pm21基因定位于簇毛麥6V染色體短臂FL值為0.45-0.58的區(qū)域;通過(guò)基因芯片技術(shù)，從簇毛麥6VS上克隆到一個(gè)與小麥白粉病抗性相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸

2、激酶基因（serine/threoninekinasegene，簡(jiǎn)稱Hv-S/TPK），并獲得含有該基因的TAC克隆，將該基因?qū)肫胀ㄐ←溨胁@得超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，表明Hv-S/TPK基因的超量表達(dá)能顯著提高轉(zhuǎn)化植株的白粉病抗性。本研究在此基礎(chǔ)上，以普通小麥-簇毛麥6V異染色體系、轉(zhuǎn)Hv-S/TPK基因小麥植株為材料，采用順序TAC-FISH和GISH、分子標(biāo)記等方法，對(duì)Hv-S/TPK基因進(jìn)行染色體物理定位，分析小麥-簇毛麥6VS

3、小片段易位系的易位類型以及白粉病抗性，對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥后代植株中Hv-S/TPK基因的染色體分布及遺傳特性進(jìn)行初步分析。
　　一、Hv-S/TPK基因的物理定位
　　TAC15是本實(shí)驗(yàn)室利用Hv-S/TPK基因的特異引物篩選小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系基因組TAC文庫(kù)，獲得的陽(yáng)性單克隆，并進(jìn)一步獲得了全長(zhǎng)為5160bp的亞克隆;對(duì)亞克隆的序列分析結(jié)果表明，Hv-S/TPK基因的外顯子序列與簇毛麥上已得到的Hv-S/TPK基因

4、的cDNA序列100％同源。本研究以TAC15克隆作探針，以普通小麥-簇毛麥6V附加系、6V代換系、6VS/6AL易位系及其衍生品種，以及6VS添加缺失系、小片段易位系為材料，采用順序TAC-FISH和GISH、分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行該基因的染色體定位。Hv-S/TPK基因?qū)；苑肿訕?biāo)記C1NAU15分析表明，在6V附加系、6V代換系，6VS/6AL易位系以及添加缺失系del6VS-1（FL值0.00-0.58）基因組DNA中，均能擴(kuò)增出特

5、異性條帶;在6V添加缺失系del6VS-2（FL值0.00-0.45），小麥-簇毛麥6VS染色體小片段易位系HY158-5（含有FL值為0.70-1.00的6VS染色體片段）、HY86-1（含有FL值為0.00-0.45的6VS染色體片段），未擴(kuò)增出特異性條帶。以6V附加系、6V代換系，6VS/6AL易位系為材料，以TAC15克隆和簇毛麥基因組DNA作探針?lè)謩e進(jìn)行FISH和順序GISH，Hv-S/TPK基因在這些異染色體系的簇毛麥6VS

6、上均檢測(cè)到1個(gè)位點(diǎn)，F(xiàn)L值為0.575士0.035。利用順序TAC-FISH和GISH方法，在抗白粉病的6V異染色體系中均檢測(cè)到Hv-S/TPK基因信號(hào)，在感白粉病6V異染色體系均沒(méi)有檢測(cè)到Hv-S/TPK基因信號(hào)。分子標(biāo)記分析結(jié)果與FISH檢測(cè)結(jié)果相吻合。
　　二、小麥-簇毛麥6VS小片段易位系的分子細(xì)胞學(xué)分析
　　以NJ1-15、NJ4、YC24、YC72-2、YC80-4、YC85-4、YC127-5、YC133-4、

7、YC135-1、YC138-4、YC146-4、YC152-2、DP67等13個(gè)小片段易位系為材料，采用順序TAC-FISH、GISH，以及6VS上的分子標(biāo)記，結(jié)合白粉病接種鑒定，對(duì)其進(jìn)行綜合分析。TAC-FISH結(jié)果表明，這些小片段易位系均含有Hv-S/TPK基因，與該基因?qū)；苑肿訕?biāo)記CINAU15分析結(jié)果一致;同一染色體制片順序GISH表明，該基因位于簇毛麥6VS染色體片段上。白粉病人工接種鑒定表明，含有Hv-S/TPK基因的植株

8、均抗白粉病。這些結(jié)果進(jìn)一步明確了Hv-S/TPK基因與小麥白粉病的抗性相關(guān)。
　　三、轉(zhuǎn)基因小麥植株Hv-S/TPK基因的FISH鑒定
　　PCR分析表明，在基因槍法介導(dǎo)的、不同世代的轉(zhuǎn)基因小麥陽(yáng)性植株中，Hv-S/TPK基因已經(jīng)整合到小麥基因組中。以這些陽(yáng)性植株為供試材料、以含有Hv-S/TPK基因的質(zhì)粒為探針，采用順序FISH方法對(duì)外源基因在有絲分裂中期染色體上的分布進(jìn)行了分析。在T1代植株H5及其后代共10株供試的轉(zhuǎn)基