家兔毛囊發(fā)育規(guī)律及其相關(guān)基因的遺傳效應(yīng)、表達(dá)規(guī)律研究.pdf

1、對(duì)于毛用動(dòng)物而言，其被毛有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。尋找影響動(dòng)物毛質(zhì)性狀的候選基因一直是眾多研究的目標(biāo)，目前的研究主要集中于人和羊，而在家兔中的研究很少，這大大制約了毛兔育種的進(jìn)展。
　　 毛發(fā)中的角蛋白相關(guān)蛋白(Keratin Associated Protein，KAP)是毛發(fā)的基本結(jié)構(gòu)成分之一，在毛皮質(zhì)中，角蛋白所構(gòu)成的中間微絲纖維(Intermediate Filaments，IFs)包埋在由KAP構(gòu)成的基質(zhì)中，二者以半胱氨酸(

2、Cys)殘基連接形成二硫鍵，共同形成毛干。在哺乳動(dòng)物中，角蛋白和角蛋白相關(guān)蛋白占毛纖維總重的65～95％，是組成毛纖維的骨架。FGF5在小鼠和大鼠體內(nèi)有重要的生物學(xué)功能，尤其是皮膚毛囊的周期性生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子，是目前研究發(fā)現(xiàn)唯一與毛長(zhǎng)有直接關(guān)系的基因。
　　 因此，對(duì)KAPs基因和FGF5基因的研究對(duì)于家兔的毛用性狀育種具有一定的意義。
　　 本研究中采取了PCR-SSCP和PCR-RFLP技術(shù)分析了閩西南黑兔、海貍色

3、獺兔、白色獺兔、九疑山兔、皖系長(zhǎng)毛兔群體的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5基因的遺傳多樣性;量取福建黃兔、德系長(zhǎng)毛兔、美系獺兔(2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、12周齡、16周齡、20周齡)頸部、背部、臀部、腹部粗毛和細(xì)毛的長(zhǎng)度，以分析家兔兔毛的生長(zhǎng)情況;對(duì)福建黃兔、德系長(zhǎng)毛兔、美系獺兔(0周齡、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、12周齡、16周齡、20周齡)的背部和臀部皮膚組織進(jìn)行了組織切片觀察，以分析其毛囊不同時(shí)期的

4、組織學(xué)形態(tài)變化;采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)福建黃兔、德系長(zhǎng)毛兔、美系獺兔(0周齡、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、12周齡、16周齡、20周齡)的背部和臀部皮膚組織中KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.本研究首次獲得了家兔KAP3.1、KAP3.3基因的全長(zhǎng)CDS序列。并將家兔KAP3.1和KAP6.1基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(HM147283和

5、HM147284，HM068868和HM068869)。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與其它物種序列的比對(duì)，家兔KAP3.1，KAP3.3，KAP6.1和FGF5基因序列與小鼠、豬、人、黑猩猩、牛等哺乳動(dòng)物的同源性均達(dá)80％以上，一方面說(shuō)明這些基因在不同物種中存在著一定的差異，另一方面說(shuō)明了這些基因在進(jìn)化過(guò)程中是相對(duì)比較保守的。
　　 本研究對(duì)不同家兔群體的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5基因的全長(zhǎng)CDS區(qū)域進(jìn)行了多

6、態(tài)性檢測(cè)。KAP3.1基因于KAP3.1-1座位上發(fā)現(xiàn)C91T突變，處于編碼區(qū)內(nèi)，但未引起氨基酸發(fā)生改變(均為絲氨酸)，為沉默突變。KAP3.3基因于KAP3.3-2座位中，發(fā)生了A358 G、CA373-374TG、A435 G和G467 T等四處突變位點(diǎn)，但這些突變位點(diǎn)均處于3’端非編碼區(qū)。本實(shí)驗(yàn)所擴(kuò)增KAP6.1基因的包括了5’端序列的基本元件(CAAT盒、增強(qiáng)子、CACCC盒、TATA盒)，相對(duì)于GenBank中的原序列(M95

7、718)，分別在5’端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)5處插入突變和CDS區(qū)域6個(gè)堿基的缺失。KAP6.1-1座位存在2種等位基因，C1等位基因相對(duì)C2等位基因在原序列的694位點(diǎn)上有1個(gè)插入(G)，并發(fā)生了G744 C和A755 G突變，且A755 G突變處于該序列的增強(qiáng)子區(qū)域。在FGF5基因上，F(xiàn)GF5-1A座位中，220～222處發(fā)現(xiàn)了TCT堿基的缺失，即絲氨酸缺失;在FGF5-3B擴(kuò)增產(chǎn)物的中發(fā)現(xiàn)了T58 C突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，

8、這兩個(gè)突變位點(diǎn)，造成了家兔FGF5基因序列的變化。其他基因座位則未檢測(cè)出多態(tài)位點(diǎn)。
　　 所有群體在具有突變的位點(diǎn)上都處于Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。KAP3.1-1座位的多態(tài)信息含量都較低，各群體的整齊度較高，其原因可能長(zhǎng)期的選育過(guò)程可能對(duì)該基因的影響不大。在KAP3.3-2座位中，閩西南黑兔、海貍色獺兔、九疑山兔的多態(tài)信息含量差異不大，均處于中度多態(tài)，說(shuō)明三個(gè)群體受到的自然和人工選擇的選擇壓大小相當(dāng)。而

9、在KAP6.1-1座位中C1等位基因頻率較高，肉兔(閩西南黑兔、九疑山兔)的多態(tài)信息含量高于獺兔和毛兔，同時(shí)皖系長(zhǎng)毛兔的多態(tài)信息含量為0，F(xiàn)GF5-1A座位中，E1等位基因頻率較高，并且皖系長(zhǎng)毛兔群體中未發(fā)現(xiàn)E2等位基因，其原因可能本研究所采的樣本數(shù)不夠大，也可能是長(zhǎng)毛兔、獺兔均是由肉兔突變而來(lái)，對(duì)于毛兔、獺兔的長(zhǎng)期選育過(guò)程可能造成C2和E2等位基因頻率的降低所致。
　　 2.本研究中以不同家兔品種初生后至青年期不同皮膚部位為研

10、究對(duì)象，分析比較了毛囊發(fā)育情況，同時(shí)測(cè)量了不同家兔品種不同時(shí)期兔毛的長(zhǎng)度以分析其生長(zhǎng)情況。
　　 福建黃兔的初級(jí)毛囊直徑不同時(shí)期增長(zhǎng)幅度最大，德系長(zhǎng)毛兔次之，而美系獺兔增長(zhǎng)的幅度最小，而平均次級(jí)毛囊直徑差異不大。家兔毛發(fā)生長(zhǎng)前期(初生后)，各個(gè)品種均較難發(fā)現(xiàn)粗毛，而后期，福建黃兔、德系長(zhǎng)毛兔粗毛率明顯上升，與家兔的毛發(fā)直徑情況相符。
　　 德系長(zhǎng)毛兔、福建黃兔、美系獺兔的次級(jí)毛囊不同時(shí)期的直徑差異不大，但在形態(tài)上具有較大

11、的區(qū)別。說(shuō)明家兔的毛囊發(fā)育與羊相似，也具有周期性，且該周期與家兔的年齡性換毛時(shí)間情況相符。
　　 德系長(zhǎng)毛兔、福建黃兔、美系獺兔的平均表皮層厚度差異不大。美系獺兔的平均表皮層厚度和皮膚總厚度(表皮層厚度+真皮層厚度)最大，福建黃兔次之，德系長(zhǎng)毛兔最小。肉兔和皮兔的皮膚厚度要高于毛兔。
　　 家兔毛長(zhǎng)性狀的測(cè)定時(shí)，相同兔種中不同部位的毛長(zhǎng)并不相同，所有兔種的背部、臀部被毛比頸部、腹部長(zhǎng);而同一部位的粗毛長(zhǎng)度比細(xì)毛略長(zhǎng)。不同

12、家兔兔毛的生長(zhǎng)波持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度不同，皮兔和肉兔的兔毛生長(zhǎng)波持續(xù)的時(shí)間較毛兔短，而早期強(qiáng)度高于毛兔。
　　 3.本研究采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)首次對(duì)福建黃兔、德系長(zhǎng)毛兔、美系獺兔不同部位皮膚組織的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5等基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在相同兔種、同一時(shí)間點(diǎn)不同皮膚組織中的表達(dá)情況并不完全相同。
　　 KAP3.1基因在所有品種中0周齡時(shí)的表達(dá)量均處于較高的水平，且在福

13、建黃兔和美系獺兔中的表達(dá)量高于德系長(zhǎng)毛兔。德系長(zhǎng)毛兔不同性別、皮膚部位的表達(dá)規(guī)律相似，總體上均處于緩慢上升趨勢(shì)。而福建黃兔和美系獺兔KAP3.1基因的表達(dá)則出現(xiàn)較大的波動(dòng)，多數(shù)部位在4周齡和12周齡時(shí)都有不同程度地下降趨勢(shì)，所不同的是該基因在福建黃兔12周齡母兔背部的表達(dá)量出現(xiàn)小幅度的上升，而在美系獺兔中出現(xiàn)顯著下降，至最低點(diǎn)。
　　 不同家兔品種的KAP3.3基因的表達(dá)趨勢(shì)與KAP3.1的表達(dá)趨勢(shì)基本相同。
　　 KA

14、P6.1基因在三個(gè)品種中不同部位不同時(shí)期的總體表達(dá)趨勢(shì)均處于波動(dòng)狀態(tài)。福建黃兔中，不同性別背部和臀部都是在4周齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低，除在12周齡母兔臀部的表達(dá)量達(dá)到最高外，其余都是在16周齡表達(dá)量達(dá)到最高。德系長(zhǎng)毛兔中，0～6周時(shí)，背部和臀部間的表達(dá)差異較大。美系獺兔中，所有不同性別和部位的表達(dá)趨勢(shì)相似，初生的仔兔均具有一定的表達(dá)量，但是不同性別和部位間的差異較大。4周齡時(shí)均降至一個(gè)較低水平，隨后有所回升且逐漸趨于平緩。
　　 初

15、生仔兔不同部位均存在一定的FGF5基因表達(dá)量，且福建黃兔表達(dá)量最高，美系獺兔次之，德系長(zhǎng)毛兔最低。福建黃兔中，雖然該基因在各階段不同性別不同部位的皮膚組織中的表達(dá)量有所不同，但整體趨勢(shì)基本一致。美系獺兔的表達(dá)規(guī)律與福建黃兔基本相同，但在12周齡時(shí)表達(dá)量的下降程度較福建黃兔明顯;而在德系長(zhǎng)毛兔中，不同部位不同性別的表達(dá)趨勢(shì)較為相似，0周齡時(shí)，F(xiàn)GF5的表達(dá)量均處于最低點(diǎn)，隨后逐漸上升。
　　 本研究中所有群體的4個(gè)基因在家兔初生時(shí)

16、均具有一定的表達(dá)量，說(shuō)明毛囊的發(fā)育和毛發(fā)的生長(zhǎng)在家兔胚胎時(shí)期就已進(jìn)行。4個(gè)基因在不同家兔品種中的表達(dá)趨勢(shì)并不完全一致，德系長(zhǎng)毛兔的KAP3.1、KAP3.3、FGF5基因表達(dá)均呈現(xiàn)出一個(gè)緩慢上升的平滑趨勢(shì)，而KAP6.1基因則呈現(xiàn)出不規(guī)則的波動(dòng)。4個(gè)基因在福建黃兔和美系獺兔4周齡和12周齡時(shí)均表現(xiàn)出較大程度地波動(dòng)，推測(cè)可能與家兔的年齡性換毛有一定的關(guān)系。同時(shí)，肉兔和獺兔的各個(gè)基因的表達(dá)規(guī)律較為接近，此結(jié)果與家兔的不同經(jīng)濟(jì)用途較為接近。同