日糧能量水平對山羊瘤胃上皮生長的影響及機理研究.pdf

1、前期研究報道高能量日糧促進瘤胃上皮生長可能與血漿IGF-1濃度升高、瘤胃上皮IGF1型受體數(shù)量增加有關(guān)，但機理不清楚。本文從整體動物、瘤胃器官和組織以及細胞、分子等不同層次系統(tǒng)研究了日糧能量水平對山羊瘤胃上皮生長的影響，并研究了高能量日糧通過IGF系統(tǒng)促進瘤胃上皮生長的細胞和分子生物學(xué)機理。
　　 1.日糧能量水平對山羊瘤胃上皮生長的影響
　　 選取18只青年波雜山羊(波爾山羊×淮南羊雜交山羊，120 d，BW14.27

2、±0.69 kg)隨機分成高能量組(HL，n=9，ME:1.00 MJ/(kg0.75·d))和低能量組(LL，n=9，ME:0.60MJ/(kg0.75·d))，飼喂42 d后處死山羊，采集瘤胃上皮樣品。游標(biāo)卡尺測量、計算瘤胃乳頭表面積;組織切片法觀察瘤胃上皮組織形態(tài);生化分析技術(shù)測定上皮蛋白、DNA和RNA含量;流式細胞術(shù)測定細胞周期;Real-time Q-PCR法測定瘤胃上皮cyclin D1、CDK4、IGF-1R、IGFBP

3、-3 mRNA表達;Western Blot方法測定cyclin D1、CDK4蛋白表達。
　　 結(jié)果顯示:
　　 1)與LL組相比，HL組山羊日增重、瘤胃干重、瘤胃上皮乳頭長度和表面積顯著增大(P＜0.05)，表明高能量日糧顯著促進瘤胃上皮乳頭生長。
　　 2)組織切片和蛋白:DNA比率的測定觀察到HL組棘突層和顆粒層細胞層數(shù)增多（P＜0.05），體積減小(P＜0.05），提示高能量日糧促進瘤胃乳頭生長主要通過

4、加速細胞增殖，而非細胞肥大。
　　 3)流式細胞術(shù)分析表明HL組G1期(DNA合成前期)細胞比率降低（P＜0.05），而S期(DNA合成期)和G2/M期（有絲分裂期）細胞比率升高(P＜0.05)，其結(jié)果可能加速細胞周期G1期進程，推動細胞從G1期進入S期和G2/M期，進而促進瘤胃上皮細胞增殖。
　　 4)HL組瘤胃上皮G1期細胞周期蛋白cyclin D1的mRNA表達提高32％(P＜0.05)，蛋白質(zhì)表達增加48％(P＜

5、0.05)，其激酶CDK4的蛋白表達增加18％(P＜0.05)，提示高能量日糧條件下山羊瘤胃上皮細胞細胞周期G1期進程加快與G1期細胞周期蛋白cyclin D1和其激酶CDK4表達升高有關(guān)。
　　 以上體內(nèi)研究表明高能量日糧提高山羊瘤胃上皮cyclin D1蛋白表達，加速細胞周期G1期進程，促進細胞增殖，加快瘤胃乳頭生長。
　　 2.日糧能量水平影響山羊瘤胃上皮生長的機理研究
　　 采用了體內(nèi)研究和體外研究的方法

6、研究日糧能量水平影響山羊瘤胃上皮生長的機理。動物試驗及樣品采集方法同系列一，實驗前、實驗第14d、第35 d分別于第一次采食前1h頸靜脈采血。放射性免疫分析法測定血清IGF-1濃度;Western blot方法測定瘤胃上皮ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白表達，得到日糧能量水平對IGF-1受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。
　　 體內(nèi)試驗研究結(jié)果顯示:
　　 1)HL組山羊血清IGF-1濃度在所測各時間點均高于LL組（P＜0

7、.05），提示高能量促進瘤胃上皮乳頭生長可能和血清IGF-1升高有關(guān)。
　　 2)HL組山羊瘤胃上皮pERK/ERK比率顯著高于LL組（P＜0.05），提示高能量日糧促進山羊瘤胃上皮ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化;體內(nèi)試驗中未能檢測到pAKT蛋白表達。
　　 體外試驗選取4只健康青年波雜交山羊，屠宰采集瘤胃上皮樣品，胰蛋白酶消化獲得單個瘤胃細胞后進行原代培養(yǎng)，24 h細胞附著后，分別加入IGF-1、專一性IGF-1R抑制劑(PP

8、P)、ERK抑制劑、AKT抑制劑處理，繼續(xù)培養(yǎng)8h或24 h后收集細胞檢測。3H-TdR摻入法測定細胞DNA合成，Real-time Q-PCR法測定cyclin D1和CDK4mRNA表達;Western blot方法測定cyclin D1、CDK4、ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白表達。
　　 體外試驗研究結(jié)果顯示:
　　 3) IGF-1(25μg/L)顯著提高體外培養(yǎng)瘤胃上皮細胞3H-TdR摻入率，較對照組

9、提高44％(P＜0.05)，IGF-1+IGF-1R抑制劑(PPP)組較IGF-1組降低了30％(P＜0.05)，提示IGF-1必須與IGF-1R才能促進瘤胃上皮細胞增殖。
　　 4) IGF-1顯著促進體外培養(yǎng)瘤胃上皮細胞G1期cyclin D1 mRNA(P＜0.05)和蛋白（P＜0.05）表達，而對其激酶CDK4 mRNA和蛋白表達無顯著影響，且IGF-1R抑制劑抑制IGF-1對cylin D1蛋白表達的促進作用（P＜0.

10、05）。提示IGF通過提高cyclin D1表達，增加G1期cyclin D1-CDK4復(fù)合物合成。
　　 5)IGF-1顯著增大瘤胃上皮細胞pERK/ERK比率（P＜0.05）;且ERK抑制劑顯著抑制IGF-1對瘤胃上皮細胞cyclin D1蛋白表達的促進作用（P＜0.05）;而體外IGF-1(P＞0.05)和ERK抑制劑（P＞0.05）對細胞CDK4蛋白表達均無顯著影響。
　　 6)體外試驗中亦未能檢測到pAKT蛋白

11、表達，而AKT抑制劑顯著抑制IGF-1對瘤胃上皮細胞cyclinD1蛋白表達的促進作用（P＜0.05），提示PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在體外試驗中起作用，其機制目前尚不明了。
　　 對體內(nèi)、外試驗結(jié)果的綜合分析可以看出:高能量日糧通過提高山羊IGF-1血清濃度促進瘤胃上皮cyclin D1蛋白合成并增加cyclin D1-CDK4復(fù)合物，從而加速細胞周期G1期進程，進而促進瘤胃上皮乳頭增殖。高能量日糧引起山羊血漿IGF-1