水稻心白突變體flo2灌漿期籽粒中miRNA鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、miRNA作為重要的負(fù)調(diào)控因子在植物中廣泛存在，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫等各類(lèi)生物學(xué)過(guò)程。水稻種子在灌漿期的生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，其發(fā)育程度和物質(zhì)積累狀況決定稻米的產(chǎn)量與品質(zhì)。目前對(duì)灌漿期水稻基因表達(dá)譜研究以及對(duì)一些參與物質(zhì)積累，尤其淀粉合成相關(guān)的基因挖掘已有大量闡述。但目前關(guān)于miRNA在水稻灌漿期是如何表達(dá)并在參與怎樣的調(diào)控作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以一個(gè)淀粉積累發(fā)生變化的心白突變體flo2和對(duì)應(yīng)野生型一個(gè)地方秈稻品種

2、白豐B為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，利用高通量測(cè)序和信息學(xué)分析小RNA庫(kù)，鑒定出在灌漿期表達(dá)的水稻miRNA，并通過(guò)小RNA芯片，比較灌漿不同時(shí)期（乳熟，蠟熟，完熟），以及白豐B和flo2中各個(gè)miRNA的表達(dá)變化，找出在灌漿期優(yōu)勢(shì)表達(dá)和變化顯著的miRNA，并通過(guò)對(duì)靶基因的預(yù)測(cè)和功能分析闡述miRNA在水稻灌漿過(guò)程中對(duì)穎果發(fā)育，尤其是對(duì)淀粉積累過(guò)程的影響。
　　 從構(gòu)建的兩個(gè)水稻灌漿時(shí)期白豐B和flo2種子小RNA庫(kù)中，通過(guò)高通量測(cè)序獲得的小R

3、NA序列總數(shù)分別為3240709和3266135個(gè)，小RNA種類(lèi)為974934和1542192個(gè)，其中與9311基因組匹配的序列數(shù)為1363246和1990385，測(cè)序深度足夠作進(jìn)一步研究。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的分析結(jié)果表明20個(gè)保守家族和約33個(gè)非保守家族的miRNA可以在庫(kù)中檢測(cè)到。此外還鑒定出了11個(gè)新的miRNA和200多個(gè)在已知基因座上但不同位置的miRNA變體。
　　 為了進(jìn)一步研究文庫(kù)中鑒定得到的miRNA在灌漿期是如何變化

4、，在flo2和白豐B灌漿的三個(gè)時(shí)期（乳熟期、蠟熟期和完熟期）分別取樣，通過(guò)小RNA芯片來(lái)分析miRNA的表達(dá)變化。芯片結(jié)果驗(yàn)證了142個(gè)已知miRNA及47個(gè)已知miRNA變體的表達(dá);有45個(gè)miRNA表達(dá)水平較高（信號(hào)值大于500）。以花后10天miRNA的表達(dá)量為參照，表達(dá)量上升的保守miRNA家族有4個(gè)，非保守家族5個(gè);表達(dá)量下降的保守家族5個(gè)，非保守家族4個(gè)。8個(gè)新miRNA也在芯片結(jié)果中驗(yàn)證。對(duì)應(yīng)白豐B灌漿各時(shí)期miRNA的表

5、達(dá)量，發(fā)現(xiàn)flo2在花后10天差異顯著(p-value＜0.01)的miRNA最多，說(shuō)明兩者miRNA表達(dá)差異主要發(fā)生在灌漿早期。
　　 對(duì)這些miRNA做進(jìn)一步的靶基因預(yù)測(cè)，驗(yàn)證和功能分析，結(jié)果顯示這些靶基因參與多種生理過(guò)程。通過(guò)5'RACE驗(yàn)證部分靶基因，其中miR1862d和miR1874-5p的靶基因GBSS1b和BE1分別參與直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成，并且兩者在flo2和白豐B的不同時(shí)期積累水平也不一樣。qPCR結(jié)果顯

6、示GBSS1b和BE1也呈現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的負(fù)調(diào)控趨勢(shì)，這可能與flo2和白豐B中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量及構(gòu)成存在差異相關(guān)，其中miR1862在flo2乳熟期的表達(dá)量要顯著高于白豐B，同時(shí)GBSS1b在flo2乳熟期的表達(dá)量要低于白豐B，該變化來(lái)自miRNA的調(diào)控并影響到flo2的直鏈淀粉含量。Q-PCR結(jié)果顯示大部分靶基因與miRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān);另一些呈正相關(guān)的miRNA如miR164和miR167，可能因?yàn)榘谢驅(qū)iRNA的表達(dá)存在反

7、饋調(diào)控作用。對(duì)靶基因的功能分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)靶基因參與種子的物質(zhì)積累和成熟過(guò)程。
　　 此外，我們還發(fā)現(xiàn)心白突變體flo2的突變基因可能會(huì)影響到體內(nèi)miRNA的表達(dá)水平。一些預(yù)測(cè)能夠標(biāo)靶該基因的miRNA在flo2中的表達(dá)顯著下降，但這種調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。
　　 本研究通過(guò)對(duì)水稻穎果發(fā)育時(shí)期的miRNA進(jìn)行分離、鑒定和表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一批在水稻灌漿期高表達(dá)并參與物質(zhì)積累和種子成熟途徑的miRNA，并首次發(fā)現(xiàn)miRNA可能