海洋細菌TC-1抗菌活性物質(zhì)對香蕉枯萎病菌(Foc4)抑制作用的初步研究.pdf

1、隨著陸棲微生物研究的進一步深入,陸棲微生物的篩選及其具有抗菌活性的次生代謝物質(zhì)的研究也進入一個瓶頸階段。海洋是人類的資源寶庫,海洋微生物所處環(huán)境獨特,能產(chǎn)生分子結(jié)構(gòu)新穎獨特的新型化合物,因此從海洋中篩選微生物資源,開發(fā)新的生物活性物質(zhì)已成世界研究熱點,具有重要意義。
　　 TC-1菌株是一株分離自海泥的細菌,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。本論文研究TC-1菌株產(chǎn)生的無菌發(fā)酵液、抗菌蛋白及脂肽類抗生素

2、對香蕉鐮刀菌4號小種(Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen Race4,Foc4)的抑制作用,以及分析了發(fā)酵液成分和非蛋白類抗菌活性物質(zhì)的性質(zhì),取得如下結(jié)果:
　　 1.采用杯碟法和生長速率法,測定TC-1無菌發(fā)酵液對Foc4的抑制作用,并對發(fā)酵液理化性質(zhì)及穩(wěn)定性進行研究。結(jié)果表明:TC-1無菌發(fā)酵液對Foc4有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑達20.1m

3、m；發(fā)酵液抑菌活性隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低,50倍發(fā)酵液稀釋液對Foc4的抑菌率為55.2％,1000倍稀釋液對Foe4的抑菌率僅為6.7％。發(fā)酵液抑菌活性熱穩(wěn)定性強,100℃下處理60min,抑菌圈直徑達19.8mm,與對照比無顯著性差異(a=0.05)；發(fā)酵液耐酸耐堿,pH2～10范圍內(nèi),抑菌圈直徑13.0～23.3mm；發(fā)酵液抑菌活性隨著鹽濃度的提高而逐漸變小,有鹽析現(xiàn)象,不同濃度鹽析沉淀抑菌活性呈倒“U”型,以濃度12％、15％

4、沉淀抑菌活性最強,抑菌圈直徑均為10.0mm,上清的抑菌活性隨鹽濃度提高而逐漸降低；乙酸乙酯抽提物對Foc4的抑制效果最好,抑菌率達58.47％。發(fā)酵液對香蕉枯萎病菌1號小種、芝麻枯萎病菌、生菜立枯絲核病菌、白菜立枯絲核病菌、辣椒炭疽病菌、黑曲霉、黑根霉、桉樹青枯病菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑分別為22.0mm、15.0mm、23.0mm、16.0mm、25.0mm、21.5mm、14.2mm、25.7mm

5、、16.0mm、20.0mm。
　　 2.采用平板對扣試驗、發(fā)酵液紫外光譜分析法、酸解發(fā)酵液氨基酸分析法、GC/MS分析法對TC-1無菌發(fā)酵液成分進行研究,結(jié)果表明:TC-1菌株產(chǎn)抑制Foc4生長的揮發(fā)性抑菌活性物質(zhì)；發(fā)酵液中含有肽類或蛋白抗菌活性物質(zhì)；發(fā)酵液有谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸等17種氨基酸和醇類物質(zhì)、酸化合物質(zhì)、鹵代物、酯化合物等32種化學(xué)成分,其中新生成27種化學(xué)成分。
　　 3.采用硫酸銨分級鹽析法、柱層析

6、法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法提取、分析發(fā)酵液中的抗菌蛋白,并對抗菌蛋白理化性質(zhì)、穩(wěn)定性進行研究。結(jié)果表明:TC-1抗菌蛋白對Foc4具有明顯的抑制作用。用50％～60％飽和度的(NH4)2SO4提取得到抗菌蛋白對Foc4的抑菌活性最強；抗菌蛋白耐高溫,120℃處理20min,抑菌圈直徑高達20.0mm,與對照相比無顯著性差異(a=0.05)；抗菌蛋白酸堿穩(wěn)定性高,pH2～9范圍內(nèi)對Foc4的抗菌性穩(wěn)定；對蛋白酶不敏感；對紫外線具有較

7、強的耐受性。經(jīng)純化后得到的抗菌蛋白,分子量約50.3KD,對Foc4的抑菌圈直徑達16.7mm；對香蕉枯萎病菌1號小種、芝麻枯萎病菌、生菜立枯絲核病菌、白菜立枯絲核病菌、辣椒炭疽病菌、黑曲霉、黑根霉、桉樹青枯病菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑分別為22.7mm、18.0mm、31.0mm、28.0mm、30.0mm、27.8mm、20.7mm、28.0mm、23.3mm、10.0mm。
　　 4.采用紙層

8、析、薄層色譜法、官能團顯色、生物表面活性劑表面活性分析法對可抑菌Foc4生長的有機抽提物進行初步鑒定。乙酸乙酯抽提物經(jīng)紙層析生物顯影,顯示對Foc4具有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑達16.3mm；TLC碘顯色表明抽提物中含有3個活性物質(zhì),其中Rf=0.83處的物質(zhì)對Foc4具有抑制作用；初步鑒定該物質(zhì)為脂肽類生物表面活性劑。
　　 5.采用酸沉-有機結(jié)合法、薄層色譜法、亞甲基藍-氯仿測定法、LC-MS分析法、生物表面活性評價、杯碟

9、法,測定TC-1脂肽抗生素對Foc4的抑制作用。結(jié)果表明:TC-1產(chǎn)生的抑制Foc4生長的抗生素為脂肽類陰離子生物表面活性劑,分子量約1097.3 Da,含量約2.31×10-4mol/L；該脂肽生物表面活性劑的臨界膠束濃度(CMC)值為35mg/L,對液體石蠟的油水乳化能力強,對正十六烷-水的排油圈直徑為11.6cm；生物表面活性對溫度、pH、鹽表現(xiàn)出較高耐受性。該脂肽抗生素對Foc4具有極強抑制作用,有效抑菌濃度為0.05g/L,抑

10、菌圈直徑為6.5mm；對溫度不敏感,120℃處理60min,抑菌圈直徑達23.5 mm；在弱酸、中性及堿性條件下較穩(wěn)定,酸性條件下抑菌活性降低。該脂肽抗生素對香蕉枯萎病菌1號小種、芝麻枯萎病菌、生菜立枯絲核病菌、白菜立枯絲核病菌、辣椒炭疽病菌、青霉、黑曲霉、黑根霉、釀酒酵母、桉樹青枯病菌、大腸桿菌均有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑分別為21.7mm、14.5 mm、25.0mm、24.0mm、28.3mm、14.8mm、24.8mm、19.