枇杷耐冷生理生化與相關(guān)基因克隆的研究.pdf

1、枇杷(Eriobotrya japonica L)為亞熱帶名特優(yōu)水果,冷害已成為枇杷產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素和瓶頸,成為刻不容緩解決的問(wèn)題。本文以枇杷為試驗(yàn)材料,采用人工降溫的方法,通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡、焦銻酸鉀沉淀的電鏡細(xì)胞化學(xué)、液相色譜、mRNA差異顯示(mRNA differentialdisplay)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)等技術(shù)和方法,對(duì)枇杷耐冷性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。建立了以葉代果鑒別枇杷耐冷性的技術(shù)體系,豐富了枇杷耐冷機(jī)

2、理的研究理論,為進(jìn)一步研究枇杷耐冷的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),并為培育耐冷新品種提供依據(jù)。主要研究結(jié)果概括如下:
　　 ⑴在借鑒植物耐冷性研究成果的基礎(chǔ)上,研究發(fā)現(xiàn)葉厚度、角質(zhì)層、表皮層、柵欄組織、海綿組織厚度在同一品種的不同樣品間會(huì)出現(xiàn)的差異,但其柵欄組織與海綿組織厚度比、CTR、SR值具有相對(duì)的穩(wěn)定和一致性。綜合分析結(jié)果初步確立枇杷耐冷性強(qiáng)弱順序?yàn)椋簷等~枇杷、黃金塊、烏躬白、早鐘6號(hào)、太城4號(hào)、香鐘11號(hào)。另外,耐冷性強(qiáng)的品種一般

3、還具有以下特征:柵欄組織與海綿組織之間自由空間小,葉肉細(xì)胞排列緊密,葉脈維管束為閉合環(huán)狀。
　　 ⑵通過(guò)測(cè)定不同枇杷葉片和果實(shí)的MDA和活性氧清除酶的活性變化,研究低溫脅迫下枇杷葉片和果實(shí)相關(guān)生理指標(biāo)與耐冷性的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)低溫脅迫的整個(gè)過(guò)程中,MDA含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加,而其清除自由基的抗氧化酶類POD、SOD、CAT和APX,只在低溫脅迫的初始階段(-3℃脅迫1.5h內(nèi)),表現(xiàn)活性上升。不同枇杷代謝活動(dòng)的適應(yīng)性變化有

4、所不同,表現(xiàn)為耐冷性強(qiáng)的品種,在低溫逆境中MDA含量變化較小,POD、SOD、CAT和APX4種活性氧清除酶的活性維持較高水平。
　　 ⑶以烏躬白、早鐘6號(hào)2個(gè)品種和一個(gè)野生種----櫟葉枇杷(Eriobotryaprinoides Rehd)為材料,測(cè)定IAA、GA3、Z和ABA4種內(nèi)源激素的變化,探索不同耐冷性的枇杷與內(nèi)源激素的相互關(guān)系。櫟葉枇杷和早鐘6號(hào)在低溫脅迫初始階段,IAA、GA3含量會(huì)有一個(gè)上升的階段,之后表現(xiàn)下降

5、,反應(yīng)了休眠期間遇到較短時(shí)間的低溫脅迫能通過(guò)自身調(diào)節(jié)保持較強(qiáng)的生理代謝能力,并未因低溫而停止生長(zhǎng)發(fā)育。ABA含量表現(xiàn)出雙峰且第二次峰值出現(xiàn)時(shí)間與凍害發(fā)生時(shí)間大致相同,而早鐘6號(hào)只有單峰,植物激素可能是一種類似Ca2+的作用機(jī)理起信號(hào)傳導(dǎo)作用,但其相關(guān)的生理生化機(jī)理尚不能明確。
　　 ⑷以櫟葉枇杷和早鐘6號(hào)為試材,用焦銻酸鉀沉淀的電鏡細(xì)胞化學(xué)方法,觀察低溫脅迫下葉片細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、移動(dòng)特征和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,并測(cè)定相關(guān)生理指

6、標(biāo),闡明Ca2+在低溫逆境下的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)低溫刺激下Ca2+會(huì)從細(xì)胞壁和液泡轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),引起細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的增大,并發(fā)生匯聚,細(xì)胞質(zhì)對(duì)Ca2+的緩沖能力的大小與耐冷性有關(guān),同時(shí)適宜Ca2+含量能提高枇杷耐冷性。
　　 ⑸以耐冷性強(qiáng)的櫟葉枇杷葉片為材料,利用mRNA差異顯示和反向northern-blot技術(shù)相結(jié)合,獲得3個(gè)與耐冷相關(guān)的陽(yáng)性cDNA片段A1、C1和C2,A1序列與已知的蓖麻、擬南芥、薺菜和楊樹(shù)的histon

7、e H4基因有80％以上的同源性。推測(cè)A1可能為histone H4基因(以下簡(jiǎn)稱H4基因)。C1序列與已知的蘋果、桃樹(shù)的ATP-dependent Clp protease(ATP依賴的絲氨酸蛋白水解酶)最大同源性分別為91％和70％。推測(cè)C1可能為ATP-dependent Clp protease基因(以下簡(jiǎn)稱Clp基因)。C2序列只有與楊樹(shù)的一種未知蛋白有15％左右的相似性,因此,推測(cè)C2可能為新基因。利用RACE技術(shù)對(duì)(Clp