大豆抗花葉病遺傳、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析及基因定位.pdf

1、大豆花葉病毒病(SMV)是世界性病害，在我國(guó)東北大豆主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響大豆的品質(zhì)和產(chǎn)量。利用抗病品種是控制SMV最經(jīng)濟(jì)有效的措施。但目前存在主栽品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗性資源匱乏，通過(guò)常規(guī)育種方法培育抗病品種時(shí)間長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題。分子標(biāo)記輔助選擇是新興的育種技術(shù)，可以有效地提高育種效果，縮短育種年限。本研究通過(guò)對(duì)抗感雜交組合后代的抗病性分析，研究抗SMVN3強(qiáng)毒株系的中選95-5117成株抗性及抗SMVN1優(yōu)勢(shì)株系的東農(nóng)93-046成

2、株抗性和種粒斑駁抗性遺傳規(guī)律，以及抗病性與農(nóng)藝性狀間的相關(guān)；分析病毒侵染抗感品種葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化；篩選出與SMVN1、N3抗性基因緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，并定位在連鎖群上；構(gòu)建了兩個(gè)大豆遺傳連鎖圖譜，對(duì)基因定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；利用本研究獲得的與抗病相關(guān)SSR標(biāo)記對(duì)70份大豆資源和雜交F3代家系進(jìn)行了抗病性鑒定，證明利用抗性相關(guān)的SSR標(biāo)記進(jìn)行抗病毒分子輔助選擇育種的可行性。具體研究結(jié)果如下： 1.利用SMVN3強(qiáng)毒株系對(duì)中

3、選95-5117×HB1的雜交后代F5和F6群體進(jìn)行了抗病性鑒定，結(jié)果表明：抗病家系與感病家系分離符合1∶1的理論比例，說(shuō)明中選95-5117對(duì)SMVN3株系的抗性受一對(duì)基因控制。 利用SMVN1優(yōu)勢(shì)株系對(duì)合豐25×東農(nóng)93-046的F1、F2和F2∶3群體進(jìn)行了抗病性鑒定，結(jié)果表明：F1植株在接種后表現(xiàn)抗病，經(jīng)χ2測(cè)驗(yàn)，F(xiàn)2群體分離比例為3(抗)∶1(感)；對(duì)F2代衍生的F2∶3家系接種鑒定，純合抗病家系、抗感分離家系和純合感

4、病家系的比率符合1∶2∶1，表明東農(nóng)93-046對(duì)SMVN1株系的成株抗性受一對(duì)顯性基因控制。 利用SMVN1優(yōu)勢(shì)株系對(duì)東農(nóng)93-046×Conrad的正反交組合F2代進(jìn)行成株抗性和種粒斑駁抗性鑒定，結(jié)果正反交后代均表現(xiàn)為3∶1的分離比例，無(wú)細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)一步證明了東農(nóng)93-046是受一對(duì)顯性基因控制的抗性親本材料。 以東農(nóng)93-046×Conrad的正反交F2代為材料，研究農(nóng)藝性狀與成株抗性和種粒斑駁抗性之間的關(guān)系，結(jié)

5、果表明：莢茸毛密度與成株抗性和種粒斑駁抗性均存在極顯著的正相關(guān)，用該性狀可以作為評(píng)價(jià)材料抗性的重要參數(shù)。成株抗性和種粒斑駁抗性之間也存在極顯著的正相關(guān)。 2.利用透射電鏡技術(shù)，對(duì)接種SMVN1和N3株系21d后抗感品種的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明SMVN3株系比N1株系對(duì)感病品種合豐25的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重，主要包括：葉綠體腫脹，片層嚴(yán)重扭曲，變模糊不清，葉綠體膜瓦解，僅剩片層結(jié)構(gòu)，嗜鋨顆粒增加較多，有大量的風(fēng)輪狀

6、內(nèi)含體出現(xiàn)，產(chǎn)生大量的束絲包裹病毒粒子，線粒體數(shù)目增加較多，細(xì)胞核核膜降解，核仁完全融解等。而抗病品種東農(nóng)93-046接種SMVN3株系和N1株系21d后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞較輕，但接種N3株系要比接種N1株系細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化更明顯，主要包括：少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核質(zhì)輕微邊聚、線粒體增多，葉綠體片層有部分?jǐn)嗔?，嗜鋨顆粒增加，并分為3種狀態(tài)，葉綠體外膜產(chǎn)生異形增生物，出現(xiàn)小泡囊等。 3.利用改良的BSA法，通過(guò)600對(duì)SSR引物對(duì)中選95-5

7、117×HB1組合的117個(gè)F5代重組自交系(RIL)進(jìn)行篩選，得到2個(gè)與抗N3株系相關(guān)的SSR標(biāo)記，即Satt114和Satt362，將抗病基因定位在F連鎖群上，2個(gè)SSR標(biāo)記與抗病基因的連鎖順序?yàn)镾att114-RN3-Satt362，連鎖距離為2.3cM-RN3-8.6cM。 用95個(gè)親本間存在差異的SSR標(biāo)記對(duì)中選95-5117×HB1組合的117個(gè)F5代重組自交系進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：中選95-5117對(duì)群體的遺傳貢獻(xiàn)率

8、為58.20％，HB1對(duì)群體的遺傳貢獻(xiàn)率為41.80％，從峰值(-0.2192)和偏斜度(-0.3990)看，群體的基因型組成近似正態(tài)分布。說(shuō)明該群體遺傳結(jié)構(gòu)較合理，分離情況較好，適合于構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜。運(yùn)用92個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建的該群體遺傳連鎖圖譜全長(zhǎng)2588.4cM，標(biāo)記間平均距離28.13cM，分子標(biāo)記密集的K連鎖群共有15個(gè)標(biāo)記?？共』騌N3在連鎖群上的位置和距離與改良BSA法的結(jié)果-致。 利用改良的BSA法，通過(guò)6

9、00對(duì)SSR引物對(duì)合豐25×東農(nóng)93-046組合的225個(gè)F2單株進(jìn)行篩選，獲得6個(gè)與抗N1株系相關(guān)的SSR標(biāo)記，抗病基因RN1定位在F連鎖群上，6個(gè)SSR標(biāo)記與抗病基因的連鎖順序?yàn)镠SP176-Satt114-RN1-Satt510-Sct033-Satt334-Satt362，連鎖距離分別為6.6cM-4.3cM-RN1-6.6cM-5.1cM-6.3cM-17.3cM。 用126個(gè)親本間存在差異的SSR標(biāo)記對(duì)合豐25×東農(nóng)

10、93-046組合的120個(gè)F2單株構(gòu)成的分離群體進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：合豐25對(duì)群體的遺傳貢獻(xiàn)率為49.15％，東農(nóng)93-046對(duì)群體的遺傳貢獻(xiàn)率為50.84％，從峰值(-0.3401)和偏斜度(-0.1952)看，群體的基因型組成近似正態(tài)分布。說(shuō)明該群體適合用于構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜。運(yùn)用115個(gè)標(biāo)記構(gòu)建的該群體遺傳連鎖圖譜全長(zhǎng)3287.3cM，標(biāo)記間平均距離28.59cM，分子標(biāo)記密集的F連鎖群共有19個(gè)標(biāo)記?？共』蛩谶B鎖群和所在連

11、鎖群上的位置與改良BSA法得到的結(jié)果相似。 4.利用SMVN1和N3株系對(duì)70份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行了抗性鑒定，選出雙抗種質(zhì)資源17份，占24.29％；單抗種質(zhì)資源9份，占12.86％；雙感種質(zhì)資源44份，占62.85％。各癥狀的發(fā)生機(jī)率不同，順序?yàn)椋夯ㄈ~＞皺縮＞黃斑＞卷曲＞矮化。 利用從中選95-5117×HB1組合篩選出的與抗N3相關(guān)的SSR標(biāo)記Satt114和Satt362對(duì)70份種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：2個(gè)標(biāo)記對(duì)

12、抗病毒資源篩選的準(zhǔn)確率分別達(dá)到82.35％和68.75％，平均為75.55％，可以用作抗病毒分子輔助育種的選擇標(biāo)記。 利用從合豐25×東農(nóng)93-046組合篩選出的與抗N1相關(guān)的SSR標(biāo)記Satt114、Satt362、HSP176、Satt510、Satt334和Sct033對(duì)70份種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：HSP176標(biāo)記對(duì)抗病毒資源篩選的準(zhǔn)確率達(dá)82.81％，Satt114、Satt510和Satt334標(biāo)記也均達(dá)到70％

13、以上，6個(gè)標(biāo)記的準(zhǔn)確率平均值達(dá)到70.71％，可以用作抗病毒分子輔助育種的選擇標(biāo)記。 利用與抗病相關(guān)的6個(gè)SSR標(biāo)記在70份種質(zhì)資源中共檢測(cè)出28個(gè)特征譜帶。依據(jù)28個(gè)譜帶對(duì)70份資源進(jìn)行聚類分析表明：70份大豆種質(zhì)資源可以劃分為兩大類群，Ⅰ類群為感病群，Ⅱ類群為抗病群。其中Ⅱ類群中均為雙抗種質(zhì)；Ⅰ類群中除4份雙抗種質(zhì)外，均為感病種質(zhì)和單抗種質(zhì)。70份種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.62-0.97，表明供試資源的遺傳多樣性