豬有腔卵泡發(fā)育與閉鎖的內分泌及分子細胞學變化研究.pdf

1、在哺乳動物卵巢中，存在大量的各級卵泡。卵泡生長過程中，僅有少數(shù)能夠發(fā)育至成熟排卵，絕大多數(shù)卵泡（99％以上）歸于閉鎖。閉鎖是卵泡發(fā)育的正常歸宿，對于維持卵巢環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。卵泡閉鎖是許多存活因子和凋亡因子共同參與的復雜調控過程，關于卵泡發(fā)育與閉鎖調控的研究雖然已有很多報道，但仍存在許多不明之處。研究卵泡發(fā)育與閉鎖調控的難度受諸多因素的影響，缺乏適當?shù)难芯磕Ｐ鸵彩且粋€重要原因。近年來，隨著細胞凋亡研究的不斷深入，人們逐漸認識到卵泡

2、閉鎖的實質就是卵泡細胞的凋亡，但顆粒細胞凋亡的調節(jié)機理尚不十分清楚。闡明卵泡閉鎖機制對于揭示生殖調控的奧秘，提高卵巢利用率和卵母細胞成熟率，提高家畜繁殖效率，均具有重要的理論意義和實用價值。
　　 本研究通過分離豬卵巢完整有腔卵泡，采用組織切片技術進行HE染色，觀察分析豬有腔卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的形態(tài)學特征;通過對分離的有腔卵泡進行培養(yǎng)，建立豬有腔卵泡體外培養(yǎng)模型，研究卵泡組織形態(tài)學與顆粒細胞凋亡及類固醇激素變化之間的關系;并采

3、用熒光定量PCR技術測定顆粒細胞Fas/FasL mRNA水平的變化;研究FSH對不同大小有腔卵泡的作用及顆粒細胞凋亡對卵母細胞發(fā)育能力的影響，以期為了解豬有腔卵泡發(fā)育與閉鎖的調控機理提供參考數(shù)據(jù)。試驗共分6個部分:
　　 試驗一、豬有腔卵泡發(fā)育與閉鎖的組織形態(tài)學觀察本試驗通過分離豬卵巢不同發(fā)育階段的完整有腔卵泡進行石蠟組織切片及HE染色，觀察分析豬有腔卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的形態(tài)學變化。分離的豬完整有腔卵泡因其內卵泡液含量豐富，

4、用常規(guī)的組織切片技術難以制作出結構自然、完整的卵泡切片。本實驗采用Bouin氏固定液固定豬分離卵泡72 h，二甲苯∶乙醇(1∶1)過渡法脫水，并適當延長透蠟時間，所獲豬分離卵泡組織切片質量和效果優(yōu)良。觀察表明，豬健康有腔卵泡的卵泡腔周圍存在少量凋亡細胞;早期閉鎖卵泡的基膜與顆粒層有不同程度的分離，顆粒細胞相互間連接松散并開始向卵泡腔脫落，個別小卵泡(＜3 mm)的卵丘-卵母細胞復合體(COC)脫落于卵泡腔，但并未觀察到卵母細胞與卵丘細胞

5、的凋亡變化;晚期閉鎖卵泡的泡膜層變形、松弛、外圍有少量脫落細胞，可見個別肥大的內膜細胞，細胞結構不清晰，與顆粒細胞層之間的界限模糊、基膜消失，大量凋亡的顆粒細胞或凋亡小體充滿卵泡腔。卵泡閉鎖過程中，大（直徑＞5mm）、中(3～5 mm)、小卵泡的細胞形態(tài)特征無肉眼可見的差別。形態(tài)學研究表明，本實驗眼觀檢查卵泡并進行早期閉鎖、晚期閉鎖、健康分類的準確率在76％～92％之間，以健康卵泡的眼觀判定最為準確，為卵泡的眼觀檢查與分類提供了依據(jù)。<

6、br>　　 試驗二、豬有腔卵泡的分離及培養(yǎng)模型的建立本試驗首次對分離的豬有腔卵泡進行體外培養(yǎng)，以期建立卵泡發(fā)育與閉鎖研究的體外模型。以TCM199為基礎培養(yǎng)液，無血清體外培養(yǎng)從豬卵巢完整分離的大(＞5 mm)、中(3～5 mm)、小(＜3 mm)健康卵泡。體外培養(yǎng)8h時，各級卵泡的形態(tài)變化與培養(yǎng)前無明顯差異;培養(yǎng)16h后卵泡壁血管逐漸模糊，中、小卵泡組的卵泡液發(fā)生輕微渾濁，整個卵泡逐漸變得不透明，此時撕開各級卵泡檢查時發(fā)現(xiàn)，卵母細胞仍

7、包被有5層及以上的致密卵丘細胞;培養(yǎng)24 h后各級卵泡結構雖保持完整，但卵泡表面開始有細胞脫落、卵泡液渾濁，22.2％小卵泡卵母細胞的卵丘細胞包被少于5層，少數(shù)卵母細胞出現(xiàn)胞質濃縮現(xiàn)象;培養(yǎng)48 h后，大、中卵泡的卵泡壁塌陷致使整個卵泡的張力消失、發(fā)生松弛。此時83.8％的大卵泡和88.3％的中卵泡，卵母細胞僅包被1～2層卵丘細胞，且排列疏松;小卵泡的卵泡壁開始溶解，顆粒細胞散在分布于卵泡液中，卵泡外觀發(fā)白，卵母細胞均成為裸卵并發(fā)生退化

8、。本實驗結果顯示，所用無血清培養(yǎng)體系可有效誘導豬完整有腔卵泡的進一步閉鎖，是用于研究促性腺激素、生長因子、細胞因子等對卵巢卵泡發(fā)育的影響及類固醇激素作用的一個適當模型。
　　 試驗三、豬卵泡發(fā)育與閉鎖過程中顆粒細胞凋亡與激素變化分析從豬卵巢分離完整的有腔卵泡，先按其質量分為3組:健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡組;按直徑大小再分為3組:大卵泡組卵泡直徑＞5mm、中卵泡組卵泡直徑3～5 mm和小卵泡組直徑＜3 mm。取健康卵泡

9、進行體外培養(yǎng)，分別于0（培養(yǎng)前對照組）、8、16和24 h，以Annexin-V FITC/PI雙染流式細胞儀檢測壁層顆粒細胞凋亡情況，放射免疫測定法（RIA）分析卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)濃度的變化。結果發(fā)現(xiàn)，不同大小的健康體內卵泡也存在少量的凋亡顆粒細胞，卵泡閉鎖時則顆粒細胞凋亡率顯著增加，這在小卵泡表現(xiàn)得尤為明顯;晚期閉鎖小卵泡中約有60％的顆粒細胞發(fā)生凋亡。健康大卵泡組卵泡液中E2濃度顯著高于中、小卵泡組;P4濃度與中

10、卵泡組無差異，但顯著高于小卵泡組。卵泡在不同健康狀態(tài)下，不同大小卵泡的卵泡液中P4/E2比值存在差異。中、小健康卵泡的卵泡液中P4/E2比值均＜5，而健康大卵泡的卵泡液中P4/E2比值＜1。卵泡發(fā)生閉鎖時，不同大小卵泡均表現(xiàn)出E2濃度顯著下降和P4濃度顯著增加，早期閉鎖大卵泡卵泡液中P4/E2比值＞1，而早期閉鎖中、小卵泡中P4/E2比值在5～15之間;當P4/E2比值＞15時，卵泡則處于晚期閉鎖狀態(tài)。體外培養(yǎng)卵泡8h，顆粒細胞的總凋亡

11、率（早期凋亡+晚期凋亡）就已達70％以上，至24 h時達81.1％～94.6％。不同大小卵泡組隨培養(yǎng)時間增加，E2和P4濃度呈逐漸下降的趨勢，小卵泡組卵泡液中E2和P4濃度在培養(yǎng)的各時間點均低于大、中卵泡組，但差異不顯著。本試驗結果表明，無血清卵泡培養(yǎng)體系可明顯誘導培養(yǎng)卵泡的顆粒細胞凋亡，顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，但卵泡閉鎖程度可因卵泡大小而異，小卵泡似乎更易發(fā)生閉鎖;卵泡液中P4/E2濃度比值可作為有腔卵泡質量判定的一個標準。

12、
　　 試驗四、豬有腔卵泡顆粒細胞Fas/FasL mRNA的表達本試驗旨在研究不同發(fā)育階段的豬有腔卵泡Fas/FasL mRNA表達與顆粒細胞凋亡的關系，探討卵泡閉鎖的規(guī)律及分子調控機理。從豬卵巢分離完整有腔卵泡，先按質量分為健康卵泡、早期閉鎖和晚期閉鎖卵泡3組;再按卵泡直徑大小分為大、中和小3組。取健康卵泡進行體外無血清培養(yǎng)，收集培養(yǎng)0、8、16、24、48和72 h的卵泡壁層顆粒細胞，用Real time PCRSYBRg

13、reen法檢測各組卵泡顆粒細胞Fas及FasL mRNA的相對表達量。豬不同發(fā)育階段有腔卵泡的顆粒細胞中均有Fas/FasL mRNA表達。卵泡閉鎖時，F(xiàn)asL mRNA表達量顯著增加，而Fas mRNA表達量與健康卵泡組相比無顯著差異。早期閉鎖卵泡組，小卵泡顆粒細胞中FasL mRNA表達量顯著高于大、中卵泡組。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同大小卵泡的顆粒細胞中FasL mRNA水平隨培養(yǎng)時間顯著增加，培養(yǎng)至24 h達最大值(P＜0.05);小卵

14、泡顆粒細胞FasL mRNA水平均高于大、中卵泡組。不同大小卵泡顆粒細胞Fas mRNA相對表達量在培養(yǎng)前(0 h)差異不顯著，培養(yǎng)8h時顯著增加，48 h達最大值。本實驗表明，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)在豬各級有腔卵泡閉鎖過程中，對顆粒細胞凋亡具有重要的調節(jié)作用。體內外調節(jié)Fas mRNA表達的因素存在差異性;體內FasL的高表達可能是啟動Fas/FasL凋亡通路的主要誘因。
　　 試驗五、FSH對分離的豬有腔卵泡體外培養(yǎng)的作用采用

15、所建立的豬有腔卵泡體外無血清培養(yǎng)體系，研究探討FSH對豬有腔卵泡體外培養(yǎng)的影響。從豬卵巢分離大、中、小健康的完整卵泡，以TCM199為基礎培養(yǎng)液分別添加1、3、5 IU/mL FSH進行無血清體外培養(yǎng)，于培養(yǎng)的0、8、16、24、48和72 h，用Annexin-V FITC/PI雙染流式細胞儀檢測各組顆粒細胞凋亡率，Real time PCR法測定FSH對壁層顆粒細胞中Fas與FasLmRNA相對表達量的影響，RIA法測定卵泡液中E2

16、和P4濃度的變化。結果發(fā)現(xiàn)，添加1IU/mL FSH對顆粒細胞凋亡的抑制作用并不顯著，F(xiàn)as與FasL mRNA表達量在培養(yǎng)的各個時間均與對照組無異。添加3～5 IU/mL FSH可顯著抑制各級卵泡的顆粒細胞凋亡，并表現(xiàn)出劑量依賴性;對大卵泡顆粒細胞的作用尤為明顯。5 IU/mL FSH可降低各級卵泡顆粒細胞Fas和FasL mRNA表達量，以24 h培養(yǎng)組作用最為顯著;3 IU/mL FSH對Fas mRNA表達量無顯著抑制作用。FS

17、H可促進大、中和小卵泡E2和P4的分泌，但均未達顯著水平。
　　 試驗六、豬卵泡發(fā)育過程中細胞凋亡對卵母細胞發(fā)育能力的影響本試驗旨在研究卵泡細胞凋亡對卵母細胞發(fā)育能力的影響，以期了解卵泡完整性在支持和促進豬卵母細胞生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用。測量豬不同發(fā)育階段有腔卵泡卵母細胞的直徑變化;并將3～5 mm直徑的健康卵泡及同等大小卵泡來源的COC分成2組進行體外無血清培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h后分別取卵泡組壁層顆粒細胞、卵丘細胞及COC組卵丘

18、細胞，用Annexin V-FITC/PI法進行凋亡分析;結合FDA染色進行卵母細胞存活鑒定，體外受精后進行卵裂率對照。結果表明，隨著有腔卵泡的生長，其卵母細胞的直徑有顯著增加;當卵泡直徑達5 mm以上時，卵母細胞直徑可達成熟時的大小。中、小卵泡一旦發(fā)生閉鎖，卵泡發(fā)育就告終止;中卵泡組發(fā)生早期閉鎖時，其卵母細胞直徑與健康組相比無差異，此時偶見少量卵母細胞(5％)發(fā)生死亡;晚期閉鎖時，中卵泡組卵母細胞直徑和存活率均顯著下降，但其存活率仍顯

19、著高于小卵泡組。小卵泡卵母細胞直徑和存活率在卵泡早期閑鎖時即顯著下降;而早期閉鎖大卵泡組卵母細胞的直徑和存活率與健康組無異。與大、中卵泡相比，卵泡閉鎖對小卵泡COC形態(tài)變化的影響更為明顯，但晚期閉鎖小卵泡卵母細胞依然有80％以上包被3層及以上的卵丘細胞。培養(yǎng)卵泡組的卵丘細胞凋亡率要顯著低于培養(yǎng)COC組，但兩組的卵母細胞存活率無顯著差異;培養(yǎng)卵泡組所獲卵裂率顯著高于培養(yǎng)COC組（24.55％對0％，P＜0.05），但均明顯低于常規(guī)COC成