轉基因克隆法制作人溶酶體β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反應器的研究.pdf

1、人溶酶體β-葡萄糖苷酶(human lysosomal acidβ-glucosidase,GlcCerase)是糖蛋白降解途徑的主要外糖苷酶,參與糖蛋白的回收利用。該酶減少或缺失會導致葡萄糖腦苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉積,從而使機體發(fā)生廣泛的病理變化,臨床上稱為“戈謝病”,酶替代法是目前該病的主要療法。人體來源的GlcCerase獲得極為困難,應用哺乳動物細胞和轉基因植物表達系統(tǒng)生產重組人GlcCerase雖然已經有一些成功的

2、報道,但也面臨許多難以克服的問題,如在CHO細胞表達重組人GlcCerase,生產成本過于昂貴；在轉基因植物中表達,存在重組蛋白質中糖鏈結構的改變以及下游加工處理困難等限制。如果應用轉基因動物乳腺生物反應器生產重組人GlcCerase,在得到天然活性較高產品的同時,將極大地降低生產成本,具有其它表達系統(tǒng)所不能代替的優(yōu)勢。然而,顯微注射法的高成本、低效率長期以來制約著轉基因動物研究的發(fā)展,體細胞轉基因與核移植相結合制備動物乳腺生物反應器是

3、當今轉基因整合表達的一種有效途徑。因此,本研究選取人溶酶體β-葡萄糖苷酶作為研究對象,首先克隆人GlcCerasecDNA序列并對其在COS7細胞中的表達進行初步研究,然后構建含有人GlcCerasecDNA的乳腺表達載體,經體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞驗證載體的有效性后,進一步將該載體轉染奶山羊胎兒成纖維細胞,篩選穩(wěn)定轉基因細胞克隆株,通過體細胞核移植法生產轉基因奶山羊克隆胚胎,以期獲得乳腺特異性表達GlcCerase的轉基因奶山羊乳腺生物

4、反應器。
　　 本研究共分為六個部分,第一、二部分進行了人GlcCerase基因的克隆、表達載體的構建及體外細胞表達研究；第三、四部分主要是分離培養(yǎng)了奶山羊胎兒成纖維細胞,并優(yōu)化了脂質體法轉染該細胞的體系,獲得了穩(wěn)定整合人GlcCerase基因的供體細胞；第五部分利用轉人GlcCerase基因的奶山羊胎兒成纖維細胞進行了核移植,研究轉基因供體細胞對克隆胚胎體外發(fā)育的支持作用,并對克隆胚胎進行了胚胎移植；第六部分探討了外源基因導入

5、對奶山羊體細胞周期分布、細胞凋亡和基因表達水平的影響。主要的研究結果如下:
　　 第一部分:人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核細胞表達試驗中,首先從人胎盤組織中分離提取得到總RNA,利用RT-PCR方法,直接獲得人GlcCerase基因的編碼序列,經測序分析,所得GlcCerase cDNA與GeneBank中同源性為99％,發(fā)現(xiàn)1個堿基差異,導致天冬氨酸到甘氨酸的改變。為了盡快檢測所獲得的目標基因是否能正常編碼獲得

6、重組蛋白質,本試驗以pEGFP-C1為基礎質粒,構建了含有人GlcCerase基因的真核表達載體pEGFP-GlcCerase。用脂質體介導法將該載體轉染入COS7細胞中進行暫態(tài)表達研究,可見報告基因GFP順利表達,經RT-PCR和熒光酶學法進行驗證,在細胞中檢測到了GlcCerase的mRNA表達,并在細胞裂解產物中檢測到了GlcCerase的生物活性。這些結果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能夠正確編碼蛋白,發(fā)揮生物學功能

7、,可以用于下一步的乳腺表達載體構建。
　　 第二部分:人GlcCerase基因乳腺特異性表達載體的構建及乳腺細胞表達試驗中,將在體外經真核細胞表達驗證正確的GlcCerase基因以及細胞篩選標記基因(Neor)插入含有山羊β-酪蛋白基因調控序列的pBCl載體中,經PCR、酶切和測序鑒定,得到正確的重組質粒pBC1-GlcCerase-Neo.為了檢測乳腺表達載體的有效性,將該載體轉染入小鼠乳腺上皮細胞系-HC-11細胞中,經G4

8、18抗性篩選,獲得陽性克隆細胞,將克隆細胞擴大培養(yǎng)后,經PCR檢測結果表明,人GlcCerase基因己成功轉入到HC-11細胞中。進一步用催乳素、胰島素及氫化可的松誘導培養(yǎng)轉基因細胞,經RT-PCR和Western—blot檢測表明,山羊β-酪蛋白基因啟動子驅動的人GlcCerase基因能夠在乳腺上皮細胞中轉錄翻譯并分泌到胞外。這些結果表明,所構建的人GlcCerase基因乳腺表達載體具有生物學功能,為下一步利用該載體進行轉基因供體細胞

9、的建立奠定了基礎。
　　 第三部分:奶山羊胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)及脂質體法轉染研究,采用組織塊培養(yǎng)法結合胰蛋白酶消化法分離純化得到奶山羊胎兒成纖維細胞,繪制了生長曲線,鑒定了胎兒細胞性別及核型特征,結果表明:該培養(yǎng)體系可以支持奶山羊胎兒成纖維細胞的體外生長,其細胞形態(tài)為梭形,高度匯合后呈火焰狀,增殖特性以及核型特征均為正常,性別鑒定顯示該奶山羊胎兒細胞為雌性,符合體細胞轉基因克隆的基本要求。進一步利用脂質體法將pEGFP-C1

10、質粒轉染入該細胞,研究了脂質體量、質粒量和轉染時間對轉染效率的影響,獲得了脂質體轉染該細胞的最佳條件:24孔細胞培養(yǎng)板中采用4.0μL脂質體轉染試劑,1.2μg質粒DNA,細胞在復合物中孵育6 h。這為下一步目的基因轉染奶山羊胎兒成纖維細胞的研究提供了參考依據(jù)。
　　 第四部分:建立轉人GlcCerase基因奶山羊胎兒成纖維細胞的試驗,利用上述優(yōu)化的轉染體系,將線性化的乳腺特異性表達載體pBC1-GlcCerase-Neo轉染胎

11、兒成纖維細胞,經G418篩選8～10天后,獲得抗性細胞克隆,進一步通過96孔細胞培養(yǎng)板分離得到來源于單個轉基因成纖維細胞的細胞克隆,經PCR擴增檢測,得到穩(wěn)定整人GlcCerase基因的轉基因供體細胞8株,和對照組細胞比較,轉基因過程中沒有導致細胞的生長和核型異常。轉基因細胞的核型(2n=58+XX)正常比例為66.8％,而第10～12代的非轉染細胞核型正常率為70.9％,二者差異不顯著(P>0.05)。這些結果表明可以利用這些陽性轉基

12、因細胞作供體細胞進行核移植研究。
　　 第五部分:人GlcCerase轉基因克隆胚胎的制備研究,采集屠宰山羊卵巢,獲取卵母細胞并體外成熟培養(yǎng),成熟率為63.3％。以100％匯合2天的轉基因體細胞作核供體,以去核的MⅡ期卵母細胞作核受體進行核移植操作。完成核移植的卵母細胞采用122 kV/cm、20μs/次、間隔1 s的直流電脈沖進行融合,融合率為83.3％,融合后的重構胚胎進一步用Ionomycin和6-DMAP進行激活處理,然

13、后轉移到SOFaa培養(yǎng)液中與單層卵丘細胞共培養(yǎng),重構胚的卵裂率為89.1％,發(fā)育至桑葚胚/囊胚期的比例為36.4％。以正常體細胞來源的核移植胚胎作為對照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分別為77.8％、90.9％和38.9％,兩種供體細胞來源的融合率和胚胎發(fā)育率差異不顯著。手術法將發(fā)生卵裂且形態(tài)正常的轉基因克隆胚(2-細胞期或以上)移植到同期發(fā)情的山羊輸卵管中,16只受體山羊中有6只一直沒有返情,在第40天經B超檢測到2只妊娠的結果

14、,但是最終妊娠沒有發(fā)育到期,胎兒發(fā)生流產。
　　 第六部分:探討了外源基因轉染對供體細胞生物學特性的影響。將構建的乳腺表達載體pBC1-GlcCerase-Neo分別轉染體外培養(yǎng)的奶山羊乳腺上皮細胞、胎兒成纖維細胞以及成年皮膚成纖維細胞,獲得整合有外源基因GlcCerase的轉基因體細胞。以非轉染的正常細胞為對照,利用流式細胞儀分析了轉基因奶山羊體細胞的細胞周期分布和細胞凋亡的情況,研究結果顯示:三種轉基因細胞100％匯合2 d

15、后,G0/G1細胞的百分比都顯著低于對照組細胞(P<0.05),其中轉基因胎兒成纖維細胞的G0/G1期比例高于其它兩種轉基因細胞；轉基因胎兒成纖維細胞凋亡率達22.56％,較對照組細胞有顯著提高(P<0.05)；然后進一步利用熒光定量PCR法探討了外源基因轉染對胎兒成纖維細胞基因表達模式的影響,檢測的基因分別為基因印記基因(IGF2,IGF2R)、凋亡相關基因(Bax)、應激相關基因(熱休克蛋白,Hsp70.1)、細胞連接相關基因(Cx