煙臺地區(qū)奶牛隱孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查及分子種系發(fā)育關(guān)系的研究.pdf

1、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(Cryptosporidium)引起的一種世界性的人獸共患原蟲病。該病對人類健康和動物生產(chǎn)帶來嚴重危害，主要造成嬰幼兒及免疫功能低下者致死性腸炎，是人類愛滋病患者死亡的直接原因之一;動物多發(fā)于幼齡，主要表現(xiàn)為頑固性下痢，即使康復(fù)亦常復(fù)發(fā)，使生長受阻，造成很大的經(jīng)濟損失。近年來，國內(nèi)外關(guān)于隱孢子蟲研究的報道逐漸增多，煙臺地區(qū)關(guān)于此病的研究較少。
　　 本研究根據(jù)GenB

2、ank中已發(fā)表的隱孢子蟲18srRNA基因設(shè)計一對引物，以從卵囊中提取的DNA為模板，對18srRNA基因進行PCR擴增，按常規(guī)方法與載體連接，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定獲得陽性重組質(zhì)粒，分別繪制質(zhì)粒DNA和奶牛隱孢子蟲卵囊的標準曲線，建立檢測奶牛隱孢子蟲18sRNA的SYBRGreenⅠreal-timePCR，并驗證real-timePCR方法的特異性、敏感性和重復(fù)性;在real-timePCR檢測隱孢子蟲方法建立的基礎(chǔ)上，對采自煙臺

3、地區(qū)6個奶牛場共565頭奶牛的新鮮糞便進行流行病學(xué)調(diào)查，分析奶牛隱孢子蟲感染與腹瀉、季節(jié)、年齡等方面的相關(guān)性;從陽性樣本中分離蟲株，對分離株18srRNA基因進行序列分析，繪制進化樹，分析分子種系發(fā)育關(guān)系，進而鑒定分離株的基因型。
　　 試驗結(jié)果表明:本研究建立的real-timePCR方法敏感性高、特異性強、重復(fù)性良好，最低檢測閾為10個拷貝的質(zhì)粒DNA和1g糞便中的10個卵囊，重復(fù)性試驗的標準差為0.494;6個奶牛場的隱孢

4、子蟲感染率分別為12.75％、9.18％、10.67％、15.11％、11.11％和5.26％，總陽性率為10.44％，隱孢子蟲感染主要來自于有腹瀉癥狀的犢牛和青年牛，并以冬季和春季為多發(fā)季節(jié);對分離到的YT1-6和YT7-16兩類隱孢子蟲的18sRNA基因測序結(jié)果表明該兩類蟲株卵囊序列與GenBank上的C.andersoni(AF093496)和C.parvum(AF108863)“mouser”型18srRNA基因核苷酸序列同源性