幾種新型分子標(biāo)記技術(shù)在中國(guó)香菇種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用.pdf

1、香菇(Lentinula edodes)是產(chǎn)量?jī)H次于雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)的世界第二大人工栽培食用菌,在我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)體系中占有舉足輕重的地位。中國(guó)幅員遼闊,地理環(huán)境和氣候條件十分復(fù)雜,孕育了豐富的香菇種質(zhì)資源,這些種質(zhì)資源是進(jìn)一步選育香菇優(yōu)良品種的基礎(chǔ)。準(zhǔn)確鑒定和客觀評(píng)價(jià)是香菇種質(zhì)資源保藏和利用的基礎(chǔ)。相對(duì)于常用的形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記而言,基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境影響,且穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、精確,已成為食用

2、菌遺傳學(xué)各研究領(lǐng)域中的重要工具。各種分子標(biāo)記技術(shù)的原理和技術(shù)體系各不相同,所揭示的遺傳學(xué)信息也不相同,因此,各分子標(biāo)記技術(shù)所反映的結(jié)果間可相互補(bǔ)充。目前,在食用菌遺傳學(xué)研究領(lǐng)域,基于通用引物PCR的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用較多,而基于物種特異性DNA序列的分子標(biāo)記技術(shù),例如,基于微衛(wèi)星兩側(cè)序列的SSR標(biāo)記、基于特定編碼基因序列的TRAP標(biāo)記及基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP和REMAP標(biāo)記,則應(yīng)用極少。
　　 本研究首次在香菇中開(kāi)發(fā)了SSR、

3、TRAP、IRAP和REMAP四種新型分子標(biāo)記的特異性引物、優(yōu)化了相關(guān)標(biāo)記的PCR技術(shù)體系,并將其應(yīng)用于香菇野生菌株及栽培菌株的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。本研究的目的是:(1)評(píng)價(jià)4種新型分子標(biāo)記技術(shù)的適應(yīng)性,為進(jìn)一步開(kāi)展香菇遺傳學(xué)研究提供新的方法；(2)從DNA水平深化對(duì)于中國(guó)香菇種質(zhì)資源遺傳多樣性的認(rèn)識(shí),為合理地保護(hù)和利用這些資源提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.采用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法及ISSR-抑制PCR法開(kāi)發(fā)香菇SS

4、R標(biāo)記,并選擇6個(gè)野生菌株和2個(gè)栽培菌株來(lái)驗(yàn)證所開(kāi)發(fā)引物的多態(tài)性。由數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法開(kāi)發(fā)出21對(duì)引物,其中11對(duì)有多態(tài)性,各位點(diǎn)平均產(chǎn)生3.3個(gè)等位基因；通過(guò)ISSR-抑制PCR法開(kāi)發(fā)出8對(duì)引物,其中5對(duì)具多態(tài)性,各位點(diǎn)平均產(chǎn)生3個(gè)等位基因。結(jié)果表明,兩種方法在香菇SSR開(kāi)發(fā)工作中均是行之有效的。
　　 2.使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及梯度PCR優(yōu)化了香菇SSR技術(shù)體系,并利用該SSR技術(shù)體系分析了中國(guó)14個(gè)省份的55香菇野生菌株和1個(gè)栽培菌

5、株的DNA多態(tài)性。25對(duì)引物共擴(kuò)增出224條DNA片段,其中的223條具有多態(tài)性(99.6％)。供試菌株的相似性系數(shù)變化范圍在0.692到0.987之間,平均值為0.803。SSR帶型重復(fù)率、DNA平均相似性系數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)的差異表明,中國(guó)自然香菇種群具有豐富的遺傳多樣性,云南高原、橫斷山脈、臺(tái)灣和華南地區(qū)菌株的遺傳多樣性尤為突出。UPGMA聚類分析及主坐標(biāo)分析都將供試菌株分為3個(gè)大的類群,類群A主要由北方菌株組成,類群C

6、由地處中國(guó)西南部的云南和廣西菌株組成,其余菌株包含在類群B中,分析結(jié)果反映了我國(guó)南北菌株之間的差異,來(lái)自相同或相鄰區(qū)域菌株具有優(yōu)先聚為小類的趨勢(shì),表明菌株的分組與其地理來(lái)源關(guān)系明顯。
　　 3.采用單因素循環(huán)篩選法優(yōu)化了TRAP-PCR反應(yīng)體系,并利用該TRAP技術(shù)體系分析了中國(guó)14個(gè)省份的55香菇野生菌株和1個(gè)栽培菌株的DNA多態(tài)性。12對(duì)引物組合共擴(kuò)增出932條DNA片段,其中的929條具有多態(tài)性(99.68％)。供試菌株的

7、相似性系數(shù)變化范圍在0.503到0.947之間,平均值為0.696。Shannon多樣性指數(shù)和平均遺傳相似性系數(shù)表明,中國(guó)自然香菇種群具有豐富的遺傳多樣性,各種群間的遺傳差異明顯,云南高原、橫斷山脈、臺(tái)灣、華南地區(qū)和東北地區(qū)菌株的遺傳多樣性比較明顯。UPGMA聚類分析及主坐標(biāo)分析都將供試菌株分為2個(gè)主要類群,類群B主要由云南菌株組成,其余菌株包含在類群A中,類群A可細(xì)分為7個(gè)亞群。分析結(jié)果很好地反映了供試菌株的地域分布規(guī)律,來(lái)自相同或相

8、鄰區(qū)域菌株具有優(yōu)先聚為小類的趨勢(shì)。
　　 4.比較SSR及TRAP分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),高多態(tài)性的SSR和TRAP技術(shù)適于研究中國(guó)香菇野生種質(zhì)。中國(guó)香菇自然種群具有豐富的遺傳多樣性,各種群間的遺傳差異明顯,分析結(jié)果較好地反映了供試菌株的地域分布規(guī)律。在8個(gè)種群中,云南高原和東北種群的獨(dú)立性比較突出。對(duì)SSR與TRAP數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合分析,其結(jié)果與TRAP分析的結(jié)果非常相似(相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99),而與SSR分析的相關(guān)性較差(相關(guān)系數(shù)為0

9、.68)?；诟鞣N群間的平均相似性系數(shù)的UPGMA聚類結(jié)果也較好地反映了各種群間的地理來(lái)源關(guān)系。
　　 5.采用單因素循環(huán)篩選法和梯度PCR優(yōu)化了香菇IRAP技術(shù)體系,并基于該體系開(kāi)展了中國(guó)44個(gè)香菇栽培菌株的IRAP和REMAP遺傳多樣性分析。19對(duì)具多態(tài)性的引物組合共擴(kuò)增出281條DNA片段,其中的273條具有多態(tài)性(99.6％)。供試菌株的遺傳相似性系數(shù)變化范圍在0.495到0.975之間,平均值為0.668。UPGMA聚

10、類分析及主坐標(biāo)分析結(jié)果都表明,供試菌株可根據(jù)栽培基質(zhì)、溫型及菌齡分為4個(gè)類群,類群A1主要包含中高溫或廣溫型代料品種,類群A2全部為中短菌齡的中溫或中低溫型代料品種,而類群A3則為中長(zhǎng)菌齡的中溫或中低溫型代料品種。類群B主要由段木品種組成。部分聚類關(guān)系較近的菌株表現(xiàn)出了某些共有的農(nóng)藝性狀特征。
　　 6.基于IRAP和REMAP分析結(jié)果,進(jìn)行了SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)工作。在供試菌株9608中獲得1條1712bp的特異性帶,在菌株L1

11、35中擴(kuò)增到1條2549bp的特異性帶。通過(guò)切膠收回克隆并測(cè)序,BLAST搜索表明,僅源于9608的特異片段與豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi)的反轉(zhuǎn)座酶相關(guān)。應(yīng)用軟件Primer3設(shè)計(jì)SCAR標(biāo)記引物對(duì),成功地將它們轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記,用于對(duì)菌株9608和L135的特異性鑒定。本研究提供了一條新的SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā)技術(shù)手段,所建立的SCAR標(biāo)記,為香菇栽培菌株的鑒定提供了準(zhǔn)確可靠和迅捷方便的新途徑。